深低温冻存复苏的外周血干细胞中ROS水平及归巢粘附分子表达之间关系的研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 深低温冻存及复苏的外周血干细胞中ROS水平 与归巢粘附分子表达之间关系的研究 目 的 stem cells，HSC)是干细胞的一种，其主要功能是 造血干细胞(hematopoietic 通过不断分化产生各系造血祖细胞，为血液系统提供新生细胞来源：同时又能自我更 新维持自身数量不变，从而长期维持机体的正常造血机能，这种分化及我更新的能 blood stemcell PBSCT)的生物学基 力是外周血干细胞移植(peripheral transplantation 础。PBSCT是治疗急性白血病和对化疗治疗敏感的实体瘤有效的方法…，它是利用 bloodstem 化疗和动员剂后外周血干细胞(peripheralcells，PBSC)～过性增高的机会 进行采集、分离、低温冻存PBSC，将其复苏后回输给患者以重建造血功能。在PBSCT 过程中，冻存技术及PBSC冻存后的归巢能力决定着PBSCT的成败。 HSC“归巢”是指HSC随血液循环最初出现在骨髓、脾、肝、甲状腺等多个器 官，而后特异性地停留在骨髓干细胞龛。研究表明造血干细胞归巢的过程是多步骤 粘附及迁移的过程乜1，目前多认为P．、E．选择素，VLA一4及其配体血管细胞粘附分子 等在HSC归巢中起关键作用呻1。细胞内活性氧(reactive oxygenspecies，ROS) CD44等表达异常，进而影响HSC的归巢能力∞1，ROS是指细胞利用氧进行能量代谢 的副产物，其主要包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等。本实验通过检测经程 控降温液氮保存前后PBSC的ROS水平及归巢分子的表达，分析二者之间的相关性， 评价深低温冻存、复苏对外周血干细胞归巢能力的影响及原因，为进一步改善冷冻 保存及复苏的条件，保护PBSC免于氧化应激损伤，维持其良好的生物学功能提供理 论及实验依据。 方 法 一、采集、冷冻保存及复苏PBSC 外周血干细胞来自中国医科大学附属第一医院血液科血液系统肿瘤患者，患者 经化疗及重组人粒细胞集落刺激因子(rHu．GCF)动员后应用COBE 的血液，进行常规临床冻存时留取相关功能检测样本，经功能检测后废弃样本。将 组，实验组细胞中添加由自体血浆、ACD抗凝剂、二甲基亚砜(DMSO)按7：2： 1比例组成的冷冻保护剂，置HBL-96型程序降温仪中进行降温，达到一86℃保持 取出标本放入37。C水浴箱中快速复苏细胞。对照组细胞中不添加冷冻保护剂及经程 控降温冷冻保存。 二、观察检测指标 Micros60血细 分别观察检测复苏的实验组及对照组PBSC以下指标：用ABX 胞计数仪进行细胞计数；0．4％台盼蓝溶液测定PBSC台盼蓝拒染率；37。C、5％C0。饱 和湿度培养14天后在倒置显微镜下计数CFU．GM集落数；流式细胞术检测细胞内 CD44的表达；研究ROS水平与归巢分子的表达之间的相关性，评价冻存、复苏PBSC 过程中ROS水平对HSC功能，特别是归巢功能相关粘附分子表达的影响。数据用 均数±标准差表示，运用SPSSl4．0统计软件分析数据，不同冻存时间的数据与冻存 前数据比较时采用方差分析，分析ROS水平与归巢分子表达之间相关性时采用相关 分析，P0．05为差别具有统计学意义。 结 果 1．PBSC经液氮深低温保存后，台盼蓝拒染率随冻存时间延长逐渐降低，PBSC冻存 1个月的台盼蓝拒染率与冻存前比较无显著性差异(P0．05)；冻存3、6、9、 12个月与冻前比较具有统计学显著性差异(P0．05)；冷冻保存半年后台盼蓝 拒染率降至8删0％，一年后的台盼蓝拒染率为70％左右。 2 2