精浆游离mRNA一般特征和附睾液游离mRNA功能的初步研究.pdfVIP

中 文 摘 要 第一部分 人cfsRNA 的提取及含量、种类、来源分析 目的：建立提取cfsRNA 的有效方法，了解其含量、种类、来源。为进一步 探索cfsRNA 的临床应用价值及存在意义奠定基础。 方法：收集精液参数正常的男性精液标本，联合应用Trizol LS Reagent 和 RNeasy Kit 提取和纯化cfsRNA ，RT-qPCR 扩增管家基因β-actin (ACTB) 比较纯化 前后RNA 提取效果，建立稳定的提取纯化技术，RT-qPCR 扩增ACTB 分析精液 参数正常男性cfsRNA 含量，并通过琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100 Bioanalyze （Lab on chip ）的双重检测，验证cfsRNA 质量及种类。用Affymetrix 公司的Human Gene 1.0 ST Array ，分析精液参数正常的男性cfsRNA 的mRNA 种类及来源。 结果：联合应用Trizol LS Reagent 和RNeasy Kit 提取和纯化的cfsRNA ，用 于荧光定量RT-PCR 所得到的ct 值比不纯化所提取cfsRNA 明显提前，差异有显 著性意义（P0.01 ）。对10 例精液参数正常标本分析，cfsRNA 含量范围为每毫 升精浆0.87 µg 到3.64 µg，RNA 分子完整性指数RIN （RNA Integrity Number ） 为6.4 。28S 与18S 倒置，比值为0.6 。Agilent 2100 Bioanalyze 的结果分析说明 cfsRNA 可能种类繁多，包括28S rRNA, 18S rRNA 和小分子RNA （如5S rRNA, tRNA ，microRNA 等）及在这一范围间大量存在的大小不等的 mRNA 分子。 cfsRNA 芯片分析结果共20106 种转录子存在，已知基因14,575 个，其中12,089 为已知基因，并有基因表达信息，其余为假基因、未知功能转录、小RNA 等。 芯片结果表达信息提示cfsRNA 来源于多个男性生殖器官，其中前列腺表达而睾 丸不表达2,009 个，睾丸表达而前列腺部表达1,529 个，前列腺和睾丸均表达2,518 个，其余6,033 个不在睾丸和前列腺中表达。 结论：联合应用Trizol LS Reagent 和RNeasy Kit 可获得大量cfsRNA，能应 用于 microarray 、northern-blot 、RT-PCR 等技术。cfs-mRNA 种类繁多，来源于 多个男性生殖器官。可能成为精浆来源器官某些疾病（如肿瘤、基因表达异常所 致疾病等）的无创性诊断、性犯罪法医鉴定等方面的新分子标志物。 关键词：精浆；游离RNA ；男性生殖系统； iv 第二部分 人cfs-m RNA 一般特性分析 实验一 人cfs-m RNA 完整性及稳定性分析 目的：考虑到上述应用前景和优势，研究cfs-mRNA 的一般特性是否满足分 子检测技术的基本要求。本部分主要是研究精液正常男性cfs-mRNA 的完整性、 稳定性、是否与其他物质结合存在。本部分的完成将为进一步研究病理情况下 cfs-mRNA 及其应用研究奠定严谨的实验基础。 方法：本部分采用分析mRNA 的完整性的公认的方法，即针对mRNA不同部 位：分别设计可扩增全长及针对5′端、3′端及中段片段的引物，收集精液参数正 常的精浆标本9 例，通过RT-qPCR 的方法定量比较ACTB 、DDX4 mRNA 各自5′ 端、3′端及中段片段的量的差异，以转录子5′端为 1，分析其3′端及中段相对5′ 端的比例，从而反映mRNA 的完整性。在室温下静置，分别于0 min、20 min 、 45 min 、90 min及24 h取出400 µl精浆，提取cfsRNA ，荧光定量RT-PCR检测人 ACTB 、DDX4 mRNA不同片段的量变及大鼠ACTB mRNA 的量变规律。 为分析cfsRNA是否以与