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广州医学院硕士论文 结直肠癌组织LV 与TAM 相关性分析 结直肠癌组织LV 与TAM 相关性分析 中文摘要 研究背景： 结直肠癌的远处转移是导致患者治疗失败和死亡的重要因素之一，血道和淋巴道 是其形成远处转移的重要途径。其中血管与肿瘤关系已有较深入的研究，然而长期以 来，由于缺乏淋巴管特异性标记物，使得对肿瘤淋巴管生成的研究明显滞后于血管生 成的研究。D2-40 为新近发现标记淋巴管的单克隆抗体，其特异性和敏感性均高，不 标记血管内皮细胞，故可用于淋巴管(lymph vessel ，LV)计数。肿瘤相关巨噬细胞 （tumor-associated macrophage ，TAM ）是肿瘤组织中浸润的巨噬细胞，其在肿瘤的生 长、侵袭、转移和复发中扮演了重要的角色。目前对TAM 与血管新生的关系研究较 多，认为其能促进血管新生。TAM 与肿瘤新生淋巴管的研究则较少，可能的原因之 一是缺乏标记淋巴管的特异性抗体。本实验应用新的特异性淋巴管抗体（D2-40 ），采 用免疫组织化学的方法，检测人结直肠癌组织中LV 、TAM 的表达，研究结直肠癌淋 巴管生成与TAM 的关系，探讨肿瘤淋巴管生成的机制。 材料与方法： 1、临床标本：人结直肠病变组织标本48 例取自 1998 年 12 月至 2000 年 12 月广州医学院第二附属医院普外科手术或肠镜下切除并经病理证实的存档石蜡。另 13 例正常结直肠组织为结直肠癌手术时距肿瘤组织5cm 以上，经病理HE 染色证实 的正常结直肠组织。患者术前均未行化疗或放疗。其中结直肠癌32 例，结直肠良性 病变组织16 例。结直肠癌中男性18 例，女性14 例；年龄38~93 岁，平均62.3 岁。 有淋巴结转移 17 例，无淋巴结转移15 例。16 例良性病变组中息肉9 例，腺瘤7 例； 男性6 例，女性10 例；年龄3.5~81 岁，平均54.7 岁。 2 、抗体和试剂盒：标记淋巴管的鼠抗人单克隆抗体 D2-40 （即用型），购于 Invitrogen 公司。D2-40 染色所需的鼠 SP 试剂盒、DAB 显色试剂盒均购自北京中杉 生物技术公司。巨噬细胞标记物CD68 的单克隆抗体PG-M1 （1：100），购自DAKO 2 广州医学院硕士论文 结直肠癌组织LV 与TAM 相关性分析 公司。CD68 染色过程中所需的SP-2001 试剂盒、二抗试剂盒、DAB 试剂盒均购自美 国Vector 公司。所有切片均设阳性及阴性对照，并进行常规HE 染色。 3、染色结果的判定及细胞计数方法： D2-40 阳性细胞定位于淋巴管上皮细胞胞 膜，呈棕黄色。微淋巴管的计数标准是每个阳性染色的内皮细胞、内皮细胞簇或单个 小脉管均视为1 个微淋巴管。参考Weidner 的方法先在100 倍视野下选择5 处阳性细 胞最密集区，然后在200 倍视野下计数，分别计算出每份标本的平均值。CD68 阳性 细胞染色位于细胞膜，呈铁锈色。参考Leek 的方法先在低倍视野下选择5 处阳性细 胞最密集区，然后在400 倍视野下进行计数，然后分别计算出每份标本的平均值。 4 、统计学分析：应用SPSS11.5 统计分析软件包对数据进行方差分析、t 检验及 Spearman 等级相关分析，当P ＜0.05 时，认为有统计学意义。 结果： 1、免疫组织化学染色形态学表现：D2-40 抗体标记的结直肠淋巴管阳性细胞呈 棕黄色，主要分布于间质中，呈圆形或类圆形及条索状。结直肠病变组织的淋巴管数 量比正常结直肠组织的淋巴管多。CD68 标记的结直肠癌肿瘤相关巨噬细胞的阳性细 胞呈铁锈色，主要分布于癌间质及癌巢间。D2-40 标记的结直肠癌淋巴管主要分布在 肿瘤周边区，数量多、管腔较大，呈扩张状，而在癌巢间或癌组织内存在稀少甚至没 有，癌组织内的淋巴管呈条索或