缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的RNA干扰联合经动脉化疗栓塞治疗肝癌的实验探究.pdfVIP

复旦大学博士论文 中文摘要 中文摘要 第一部分 RNA干扰慢病毒的制备和干扰靶点评价 缺氧诱导因子．1a 目的。 将设计的缺氧诱导因子．1a(HIF．1a)的RNA干扰靶点连接到慢病毒载体，并 确定其能否有效转染McARH7777细胞，评价敲低HIF．1a的程度，选择最佳靶 点用于后续研究。 方法： 扰靶点分别连接到pGCSIL．GFP慢病毒载体；将连接产物转化到大肠杆菌感受态 细胞中，选择阳性菌落进行PCR扩增和基因测序鉴定RNA干扰靶点是否成功连 接到慢病毒载体；进一步将连接有RNA干扰靶点的慢病毒载体进行扩增并进行 RH7777 滴度测定：应用慢病毒载体转染McARH7777细胞，将转染后的McA 细胞进行细胞爬片和DAPI染色确定转染效率，并进行荧光定量反转录聚合酶链 反应试验，确定转染后HIF。la敲低的程度。 结果： 将RNA干扰靶点均连接到慢病毒载体并转化到感受态细胞，对阳性菌落 进行PCR扩增，各靶点病毒载体的扩增长度分别为：NC，343 bp,Targetl，347bp： bp；Target3，347bP,Target4，346bp。经基因测序中证明RNA干 Target2，347 扰靶点均连接到慢病毒载体。成功对慢病毒载体进行扩增和滴度测定，各载体的 滴度分别为：HIF．1a．LV-NC，5E+9TU／ml，HIF．1a．LV-Targetl，4E+8TU／ml； HIF-la—LV-Target2，5E+8TU／ml；HIF-la-LV-Target3，7E+8TU／ml；HIF—la-LV- RH7777 TU／ml。经细胞爬片和DAPI染色确定慢病毒转染McA Target4，7E+8 细胞的效率均在95％以上；在各病毒转染McARH7777后，经反转录聚合酶链 反应试验确定HIF．1a的相对表达量分别为：Wild type，1．01士0．09；NC，1．02士 4-0．10,Target4， 0．824-0．1 l。选择靶点Target2作为后续的实验研究的靶点。 结论： RH7777细胞，并有着较高的转染效率；在 毒载体pGCSIL—GFP能够转染McA 复旦大学博士论文 中文摘要 McARH7777细胞中，可以通过RNA干扰的方法敲低HIF．1a的表达。 关键词：缺氧诱导因子．1；肝细胞肝癌；慢病毒； RNA干扰 第二部分 缺氧诱导因子．1Q的RNA干扰减低缺氧肝癌细胞的增殖、迁移 和侵袭能力 目的： 本研究探索慢病毒调节的HIF—la的RNA干扰在缺氧的条件下能否敲低 HIF．1a的表达和进一步抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达，能否抑制HCC细 胞的增殖，侵袭和迁移能力。 方法： 应用慢病毒构建HIF．1a的RNA干扰载体感染大鼠肝癌细胞系McA RH7777，在正常氧条件和缺氧的条件下进行不同时间段的培养。应用反转录聚 合酶链反应和免疫印迹分别检测HIF．1a和VEGF的RNA和蛋白表达水平。通 过细胞活性实验，Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞的增殖，迁移和侵袭 能力。 结果： 反转录聚合酶链反应分析结果：在常氧条件下，HIF．1etRNA干扰分别使 McA 和VEGF的mRNA表达在RNA干扰组和对照组的相关系数分别是O．84和O．