绿脓杆菌制剂对乳腺癌细胞生物学特性的影响和机制研究.pdfVIP

绿脓杆菌制剂对乳腺癌细胞生物学特性的影响及机制研究 复旦大学博士论文 绿脓杆菌制剂对乳腺癌细胞生物学特性的影响 及机制研究 中 文摘要 目 的 sensitive 检测绿脓杆菌制剂(PA-MSHA，Pseudomonasaeruginosa—manllose hemagglutinin)对人乳腺癌细胞的生物学特性包括抗增殖、诱导凋亡特性等的影 响，并深入探讨其作用靶点以及体内体外实验中对人乳腺癌细胞的作用机制。 方 法 第一部分 1、 光学显微镜观察PA．MSHA作用后细胞形态变化。 2、 WST(water-solubletetrazoliumsalt)法测定PA．MSHA以及PA对入乳腺 癌细胞或正常乳腺上皮细胞体外增殖的影响，并绘制细胞增殖曲线。 3、 标准PI染色流式细胞计数法(flow 人乳腺癌细胞细胞周期分布的影响。 4、 Annexin V-FITC和PI染色流式细胞计数法检测PA．MSHA对人乳腺癌细 胞凋亡的影响。 6、 透射电镜观察PA．MSHA作用后乳腺癌细胞形态的变化。 7、 Western blot法检测PA．MSHA或PA作用后凋亡相关级联蛋白水平的变 化。 第二部分 1、 采用甘露糖或葡萄糖作用PA．MSHA共培育试剂，与PA．MSHA或PA共 绿脓杆菌制剂对乳腺癌细胞生物学特性的影响及机制研究 复旦大学博士论文 同作用于乳腺癌细胞，作为竞争性作用试剂，来检测其对PA．MSHA作用效 应的影响。主要采用WST法、AnnexinV-FITC和PI染色流式细胞计数法、 Hoechst33258染色、扫描电镜、westernblot等方法检测甘露糖共培育对 PA-MSHA引起的抗增殖、细胞凋亡、细胞周期阻滞等的影响。 2、 通过Western blot检测PA．MSHA作用于乳腺癌细胞后EGFR通路下游主 的表达水平。 3、 设计并合成针对人EGFR基因的RNA干扰片段，将siRNA片段瞬转入乳 腺癌细胞中，Westernblot法验证片段下调EGFR表达的有效性。主要观察 EGFR下调后PA．MSHA对EGFR下游通路蛋白表达水平以及细胞增殖水平 的影响，以验证EGFR是否为PA．MSHA作用靶点。 4、 通过Western blot以及ELISA方法检测PA．MSHA作用于乳腺癌细胞后侵 袭转移相关基因表达的影响。 5、 fat 裸鼠乳房脂肪垫(mammarypad，MFP)接种人乳腺癌细胞，探讨 PA．MSHA对裸鼠原位肿瘤生长及肺转移的影响。 结 果 第一部分 1、 PA．MSHA对乳腺癌细胞有直接杀伤作用，且有剂量依赖性以及时间依赖性， 而对MCF．7细胞以及正常乳腺上皮MCF-10A相对耐药。而PA对乳腺癌细 胞没有明显的杀伤作用。 2、PA．MSHA在体外能引起Go．Gl期的细胞比例增高，而S期细胞比例显著 降低。 3、PA-MSHA作用后能使乳腺癌细胞呈现出大量的圆形漂浮凋亡细胞形态， 产生大量的吞噬体以及自噬体样空泡，体现为凋亡