ZFN、TALEN、CRISPRCas.pptxVIP

主要内容;一、基因修饰;基因修饰原理;;ZFN;图1 ZFN三维结构;TALEN;按照DNA序列将相应TAL单元串联克隆即可获得识别某一特定核酸序列的TALE。将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联,可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALENs。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻(间隔13-22 bp)的靶序列(一般16-20 bp)分别进行TALE识别模块构建。将这两个相邻靶点识别模块（分别）融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表达载体，得到TALEN质粒对。 将TALEN质粒对共转入细胞，表达融合蛋白，分别与靶位点特异结合。由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近，可以形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA形成DSB，诱发DNA损伤修复机制NHEJ修复DNA，删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。 ; ZFN与TALEN： 优于TALEN 经验积累多???技术较成熟 逊于TALEN 技术复杂，难度高，被Sigma公司垄断 靶点序列特异性要求比较高 缺点： ZFNs和TALENs这两项技术在实施操作过程中技术难度较大、构建组装时间较长。脱靶现象严重，易在细胞中积累造成显著细胞毒性。;CRISPR/Cas;1 CRISPR-Cas概述;2 CRISPR/Cas作用过程;图6 CRISPR/Cas作用模式 ;三、 CRISPR/Cas应用前景;从实际应用的角度来讲，CRISPRs比ZFN、TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。 ①只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。 ②编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。 ③较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。 综合比较， CRISPRs比传统方法具有更高的突变率，可以对多个基因进行多点突变，同时使遗传学研究不再局限于模式生物中，因此可以预见在将来会有很大的应用价值 ;