在氨基酸反应探讨左旋门冬酰胺酶杀伤MOLT-4细胞的机制.pdf

·中文论著摘要· 在氨基酸反应中探讨左旋门冬酰胺酶杀伤 MOLT-4细胞的机制 目的 P-]以使 leukemia，ALL)的重要化疗药物之一。单独使用L—asp (Acutelymphocytic 儿童ALL的完全缓解率达到4096—60％。其作用机制如下：它可以水解血液／培养液 中的门冬酰胺，导致细胞内的门冬酰胺水平降低，令细胞蛋白质合成受阻，细胞 趋于凋亡。尽管L-asp是一种历时弥久的老药，但其杀伤细胞的具体分子机制仍不 清楚。 本实验通过对T淋巴细胞白血病细胞系MOLT-4进行体外实验，研究L—asp mRNA在 对MOLT-4细胞的增殖抑制作用，并观察ASNS、CHOP、Bax及Bcl2 L．asp作用后不同时间点的表达情况，从中探讨可能存在的凋亡机制。这在国内外 文献未见报道，本研究将为L．asp的作用机制提供新的理论依据。 方法 一、细胞培养及胎盼兰拒染法检测细胞存活率 将MOLT-4细胞进行复苏培养，急性T淋巴细胞白血病MOLT一4细胞株，置于含10％ 1640培养液中，在37(2、 胎牛血清， 100IU／ml青霉素，100mg／ml链霉素的RPMI 5％C02、饱和湿度培养箱内培养，每2d至3d传代1次。取对数生长期细胞，接种至 6：IL培养板，细胞浓度为5×105／ml。培养24h后实验分组如下：1．对照组(细胞培 养液中不加任何药物)；2．实验组：用1IU／mlL-asp处理。实验组和对照组分别于 加药处理后的12h，18h，24h，48h，96h计数活细胞数。计数时先制备细胞悬液，用 0．2％台盼蓝染色以判定细胞活性(活细胞不着色)，取少量细胞悬液滴于细胞计数 板上，显微镜下计数。 三、实时定量荧光PCR 分别收集用1 盒说明书配置逆转录反应体系合成cDNA；引物由Takara公司设计合成，采用 SYBRGreen Green I实时定量荧光PCR方法，以GAPDH为内参照，进行SYRB mRNA表达水平。 I实时荧光定量PCR，检测ASNS、CHOP、Bax及Bcl2 四、结果判断 将标准品eDNA 10倍浓度梯度稀释为5一个浓度梯度，各取2“L作为模板 进行RealTimePCR反应，由各扩增曲线得到的CT值制作标准曲线，从而得到样 通过目的基因和内参基因拷贝数的比值进行样本间相对定量的比较。 五、统计学分析 for 采用SAS(SASWindows，9．2版本)软件进行统计分析。实验结果用(；士s) 不同的时间点的差异表达情况。 幺士蟹 拿日木 一、方法的可靠性和准确性 l、RNA的纯度和质量分析 所提取的总RNA经紫外分光光度计检测，比值在1．81．0之间，经琼脂糖凝 胶电泳鉴定，条带清晰可见，无明显降解。 2、扩增的特异性及定量的准确性 标准品cDNA经梯度稀释后进行PCR反应，制作标准曲线。得到的标准曲线相关 系数(r2)均0．998，斜率在．3．3至．3．5之间，反映定量准确，扩增效率良好。扩增 后溶解曲线显示锐利的单一锋，无其他非特异性锋，说明扩增产物均一，无非特 异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳进一步验证扩增片段的均一性及长度。 2 二、llU／ml L-asp对MOLT-4细胞增殖的影响 11U／ml 率与细胞存活数。18h之前实验组与对照组的细胞存活率无显著差异(PO．05