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外周血循环肿瘤细胞的EGFR突变的检测 中文摘要 目的： NSCLC患者在EGFR-TⅪ治疗的获益。 方法： 首先将H1975细胞株混入抽取的正常人血液内，模拟NSCLC患者外周血。 使用免疫磁珠阴性法富集CTC，再使用免疫荧光染色的方法鉴别循环肿瘤细胞， 并尝试了FISH法辅助鉴别CTC。比较了包括激光显微切割(LCM)在内的多种 单细胞分离技术。对比研究了单细胞和多细胞PCR的扩增阳性率；研究了单细 胞全基因组扩增(WGA)与巢式PCR扩增阳性率的关系；并使用测序的方法进 行了单细胞EGFR基因突变检测。 结果： 通过免疫磁珠阴性富集和免疫荧光染色，混入血液内的H1975细胞回收率 达到77．2士9．5％；并论证了LCM对本实验的适用性和意义。多细胞PCR的阳性 扩增率也仅为50％，不显著优于单细胞PCR。使用WGA不能明显的提高巢式 PCR的扩增阳性率，但是对于单细胞的多位点检测有重要的意义。通过本方法 的处理，测序法的敏感性即可满足EGFR基因突变的检测要求。 结论： 本研究所建立的外周血单个CTC的EGFR基因突变检测方法在H1975细 胞株上已得到充分的验证，有望于NSCLC患者上取得结果。本方法也可用于其 他任何实体瘤的单细胞多基因位点的检测，对于肿瘤学的研究提供了新的研究途 径。 关键词： 循环肿瘤细胞；EGFR；免疫磁珠阴性富集；免疫荧光染色；激光显微切割； 全基因组扩增；单细胞巢式PCR；测序 4 EGFRmutationsinthe Detectionof Circulating tumor ceUs(CTC) Abstract objective。 for W|eai】nt0establishamemod E(疆Rmll切tions．m CTC，t0 deteCting guide fortlleNSCLC EGFR·TKI仃eannemdecisioIlS patients． MethOd： lniXedH1975ceU、析tllwlloleblood舶m toIIli面c Firstly，we healnlysubject ⅡleCTC．TlletllIll．0rcellswe聆tlleneIlriched selection bymgative using f如m identifiedbloodcells beads，a11d iIlmlunom秘tic by memodt0 cells． teSted嬲肌ahenlative 觚11ing．FISH、Ⅳ勰alS0 identi黟tIJIIlor L敬r o恤rmethodst0 CaptureMicrodis∞c石on(LCM)、)l，