发酵降解牛骨粉产酸菌株的分离与初步鉴定.docVIP

发酵降解牛骨粉乳酸菌株的分离与初步鉴定 作 者：夏再波 指导老师：娄爱华 （湖南农业大学食品科技学院2004级食品科学与工程三班，长沙 410128） 摘 要：本实验采用MRS培养基，从土壤中自然降解半年的牛骨中分离乳酸菌，经过多次试验，反复分离纯化得到了5株乳酸菌，并根据它们的生理特性进行了初步的鉴定。经鉴定确定了两株乳杆菌属和三株链球菌属，然后将选出的菌种做骨粉发酵生产试验，并从中选出产量丰富的T7菌做生长曲线，以观察其生长情况，从而为工业化生产奠定基础。 关键词：乳酸菌; 分离; 鉴定 前 言 骨组织在动物体中约占体重的20％～30％，是一种营养价值非常高的肉类加工副产品，它含有大量的蛋白质、脂质、矿物质等营养成分。尽管骨粉已在畜牧养殖生产中大量使用，但是由于对骨粉认识上的不足，动物骨头的浪费严重，骨粉的营养价值也未得到充分利用。面对我国的肉类加工产量逐年上升，抛弃的动物骨头越来越多的状况，如何合理加工和充分利用动物骨头成为十分重要的课题。 骨粉中含有丰富的矿物质，最主要的是羟磷灰石晶体[Ca10(PO4)6(OH)2 ]和无定型磷酸氢钙(CaHPO4 )，在其表面还吸附了Ca2+、Mg2+、Na+、Cl-、HCO3-、F-及柠檬酸根等离子。更为重要的是，骨粉中丰富的Ca和P是人体必需的常量矿物元素，而且它们的比例(Ca：P=2：1)是体内吸收钙磷的最佳比例。另外，骨髓中含有大脑不可缺少的磷脂质、磷蛋白、胆碱还有加强皮层细胞代谢和防衰老的骨胶原、类粘朊、酸性粘多糖(即软骨素)、维生素等。这些营养组分特别有利于儿童的健康成长和老年人的滋补需要，还能满足高血压、骨折、骨质疏松、糖尿病、佝偻病、贫血等患者对食品的特殊需求。 利用微生物的作用可以降解骨粉中的蛋白质、粘多糖，使部分钙从结合态游离出来。该法兼有酸解、酶解、生物转化的共同作用，是一种比较新而且效果好的方法。而要想利用微生物发酵法来提高钙的利用率，首先必须分离筛选出高产酸的乳酸菌菌株，并对其进行特性研究，进而探讨乳酸菌对骨粉中结合钙转化成游离钙的情况。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种来源：在土壤中自然降解半年的牛骨 1.1.2 主要原料和培养基 牛骨骨粉：1#（50目），2#（80目），3#（120目）由长沙市马王堆蔬菜批发大市场提供。 富集培养基：MRS培养基 MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO4?7H2O 0.58 g，MnSO40.25g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.4，121℃ 灭菌20min。(MRS固体培养基：在液体培养基的基础上添加1.8%的琼脂，半固体MRS培养基琼脂的添加量为0.8%) 鉴别培养基： PY基础培养基, 葡萄糖和葡萄糖酸盐产酸产气培养基，碳水化合物发酵产酸试验培养基，淀粉水解培养基，石蕊牛奶培养基，明胶液化试验培养基，乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）培养基，H2S试验培养基，葡聚糖产生试验培养基 （1）PY基础培养基:蛋白胨 0.5g，胰酶解洛蛋白0.5g，酵母提取物 1.0g，盐溶液 4.0ml，蒸馏水100ml，盐溶液成分：无水CaCl2 0.2g，MgSO4?7H2O 0.48g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，NaHCO3 10.0g，NaCl 2.0g。 方法：将CaCl2和MgSO4?7H2O混合溶解于300ml蒸馏水中，再加500ml水，一边搅拌一边缓慢加入其他盐类。继续搅拌直到全部溶解，加200mL蒸馏水，混合后贮备于4℃。 （2）葡萄糖产酸产气培养基 在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和0.5ml的吐温80，再添加6g琼脂做成软琼脂柱，同时加入浓度为1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL指示剂，分装试管，高度4～5cm。置于112℃灭菌20～30min后备用。 （3）碳水化合物发酵产酸试验 基础培养基：（NH4）HPO4 1.0g，KCl 0.2g，MgSO4 0.2g，酵母提取物 0.2g，琼脂 5～6g，蒸馏水 1L，浓度为0.04/100ml的溴百里酚蓝 20ml。添加各碳水化合物的量如下表1： 培养基的基质 数量g(ml)/100ml 灭菌后PH值 高压蒸汽灭菌时间/min 乳糖 1.0g 6.9 15 葡萄糖 1.0g 6.9 15 蔗糖 1.0g 6.9 15 木糖 1.0g 6.7 15 山梨醇 1.0g 6.9 15 麦芽糖 1.0g 6.9 15 鼠李糖 1.0g 6.9 15 纤维二糖 1.0g 6.9 15 甘露醇 1.0g 6.9 15 （4）淀粉水解 淀粉培养基：蛋白胨 10.0g，氯化钠