碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件初探.docVIP

碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件初探 高玉千，李林柯，刘琦 （河南农业大学生命科学学院，郑州，450002） 摘要：从四个不同地点采集土壤样品，分离筛得到一株碱性蛋白酶初步鉴定为枯草芽孢杆菌。实验证明其最佳产酶pH8.5温度53℃时间60h为下一步进行蛋白酶基因的克隆和诱变基础。 枯草芽孢杆菌蛋白酶Alkaline Protease Gao Yu-qian, Li Lin-ke, Liu Qi (College of Life Sciences, Henan Agriculture University, Henan, Zhengzhou, 450002) Abstract：alkaline protease strains were isolated from soil samples, within one strain named B4 was selected and identified as Bacillus subtilis. The optimum conduction for the protease producing consisted of pH8.5, 53℃ and after 60h fermentation. The research could do good preparation for the clone and the mutagenesis of the protease-gene. Keyword：Bacillus subtilis alkaline protease 20世纪末国际市场上商品蛋白酶多达80多种，其销售额占酶制剂总销售额的60%以上，而微生物碱性蛋白酶又占了整个蛋白酶40%左右的市场份额，被认为是最重要的应用型酶类[1]。虽然人们对蛋白酶的研究和利用已有多年的历史，但仍存在蛋白酶制剂品种单一、价格昂贵等问题，加上各国都十分注重对已有的重要微生物资源的保护，使得产酶优良菌株的筛选和选育仍是重要的课题，特别是对于发展中国家更是如此[2，3]。本研究从土壤入手，筛选产蛋白酶的，并对其酶学性质进行系统的研究为获得蛋白酶的基因；对蛋白酶基因进行诱变提高奠定基础。 l 1.1 材料 1.1.1 样品来源 从河南农业大学校园郑州奶牛场菜园杜邦大豆蛋白公司1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基用于分离细菌菌落；LB培养基用于菌株的保藏及平板筛选；含1%脱脂奶的L B固体培养基3%豆粕粉豆粕培养基1.2 主要仪器与设备 SCS-24型和THZ-82型SW-CJ-IC型净化工作台CS501A型超级恒温器pHS-3C型数字型精密pH计、721型分光光度计Sigma公司产3K30型冷冻超速离心机 1.3 方法 1.3.1土壤样品的采集 选取采集地点地表植被根系周围的土壤，首先去除地表浮土，然后挖取2-5cm深的土壤样品，每个样品约取500g土壤，装入塑料袋内，备用[]。取50g土壤样品置于250ml三角瓶中，加入100ml无菌水，用玻璃棒搅拌，静止15min后，涂布于豆粕培养基上，置于37℃培养箱中培养60h。然后根据菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、边缘形状和菌落颜色[]，最终挑选出若干个细菌菌落 1.3.3 菌株的筛选 分离到的菌株采用分别接种于脱脂奶培养基置于37℃培养60h。室温下观察接种的菌株是否分解培养基中的脱脂牛奶，进而产生肉眼可见的水解透明圈即可产生分泌胞外蛋白酶。 将可产生透明圈的菌株重新接种脱脂奶培养基，置于37℃培养60h。(H/C)大小进行初筛，从中选取蛋白酶活力相对较高的进行摇瓶复筛。 将初筛得到菌株分别接种于l00ml 豆粕培养基中，37℃摇瓶培养60h。然后取10ml培养液，再次接种到100ml 豆粕培养基中，37℃摇瓶培养60h后，取10ml培养液，离心收集上清液，用Folin酚法[]测定上清液中蛋白酶的活力。根据OD660吸光数值的大小，初步确定这些菌株产生的蛋白酶的活力。选产酶活力最高的菌株作酶学性质分析。 酶学性质分析将菌株接种于00ml豆粕培养基中，至于37℃摇床培养，每隔12h取出10ml培养液，测定菌体生长量（OD660），离心收集上清液，然后测定上清液中的pH值和蛋白酶的活力 [] 。 将菌株接种在100ml豆粕培养基中，置于37℃摇床培养60h后，离心收集上清液，然后测定蛋白酶的活力。在测定蛋白酶活力时，分别选择不同的酶反应的pH值，然后测定酶活力。 将菌株接种在100ml豆粕培养基中，置于37℃摇床培养60h后，离心收集上清液。加入反应物后，在不同温度的水浴中反应10min后，再加入2ml 0.4mol/L三氯乙酸终止反应。测定酶活。 配制ml无菌生理盐水数管，取出一管接复筛菌一环，混匀后取出1ml加至另外一管中，依