基因扩增-PCR.PPT

Real-time PCR 两种标记技术 染料染色 SYBR Green 探针标记 TaqMan SYBR Green染料 染料法的优缺点 成本低 广谱性 适合初筛 无模板特异性 灵敏度低 条件优化 探针定量原理 阈值 CT值 荧光信号穿过阈值线时的循环次数 基线的调整 基线 阈值 CT值 CT值15，自动分析 CT值15，手动分析 GATC GATC CTAG CTAG GATC GATC CTAG CTAG CTAG GATC GATC CTAG 质粒DNA 目的基因 Bam HI限制性内切酶 基因克隆 2)基因检测 A’ 内源性病变基因 正常人 A 病 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等 地中海贫血 珠蛋白链合成不平衡 A 正常人 病 人 正常 病人 ASO探针法 A C T G ASO探针 正常 病人 探针杂交 NC膜 探针 正常人 突变纯合子 突变杂合子 基因扩增-PCR PCR-RFLP法： 限制性内切酶 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） ras 基因 突变 限制性内切酶 基因扩增-PCR 正常 突变 电泳 基因扩增-PCR HLA系统基因分型 PCR-RFLP法 PCR-SSO法 PCR-SSCP PCR-SSP 3)基因配型 PCR-SSP 1 2 3 4 5 6 7 8 PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 引物特异性 4）基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 5）法医学分析 个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLP DNA指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序 PCR-VNTR多态性检测 PCR；电泳检测 父’ 父 子 母 基因扩增-PCR 现 嫌1 嫌2 嫌3 基因扩增-PCR （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 基因扩增-PCR （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 基因扩增-PCR （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 基因扩增-PCR 2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 基因扩增-PCR （3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 基因扩增-PCR PCR的类型 Asymmatric PCR Reverse PCR Multiplex PCR Labelled primer PCR Anchored PCR Solid phase PCR In stiu PCR ＲＴ－ＰＣＲ Real-time PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 1）不对称PCR（asymmetric PCR ） 高浓度引物 低浓度引物 2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进