稳定表达软骨节素I的大鼠MSCs细胞株的建立.pdfVIP

稳定表达软骨调节素I的大鼠MSCs细胞株的建立 硕士生姓名： 周连仲 指导教师： 翟立杰教授 专业名称： 耳鼻咽喉科学 摘要 目的：构建pcDNA3．1(+)／ChM—I表达载体，稳定转染大鼠骨髓间充质干细胞， 一步开展ChM-I诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化，构建组织工程软骨相 关研究打下基础。 方法： 3’， 下游引物为：5’GcAGACGCGGCCGCTTACACCATGCCC从GATG 3’，通过PCR获取ChM-I 克隆并扩增，酶切鉴定阳性克隆，并对插入的ChM-I片段进行测序。 2．密度梯度离心法获得大鼠MSCs，传代培养并扩增。使用流式细胞技术检测 细胞表面抗原；对大鼠MSCs进行成脂及成骨诱导培养，检测所获得MSCs的潜在 分化能力。 3．脂质体法将质粒转染进大鼠MSCs。实验分三组：实验组(转染pcDNA3．1 换完全培养基，48小时后加入200ug／mIG418筛选培养基，使用筛选培养基持续传 代培养并扩增实验组和对照组细胞，以获得稳定转染质粒的大鼠MSCs。 Western 的转录和表达，鉴定所筛选的大鼠MSCs细胞株中ChM-I的上调表达及其稳定性。 结果： 1．对阳性克隆鉴定及测序和序列分析对比，结果显示与ChM-I基因长度相符， 序列无误，且读码框正确。 2．单细胞悬液接种48小时后换液，倒置显微镜观察并拍照，可于培养皿底部 见到呈梭形或三角形的贴壁细胞，培养11-13天后培养皿底部细胞密度达到90％ 以上。细胞传代，在6小时内可达80％以上贴壁，细胞生长速度加快，可见细胞呈 成纤维细胞样生长，折光性较强，可呈鱼群样生长。流式细胞仪鉴定结果：MSCs CD45、CDI Ib／c的表达率分别为2．77％、2．51％。成脂诱导2周后，油红O染色， 脂滴为橙红色；成骨诱导3周后，茜素红染色，镜下显现为红色斑片。 3．转染复合体作用6小时后，可见大量MSCs胞质内出现折光性强的小泡，提 天后空白组出现少量细胞漂浮死亡，实验组和对照组也可见少量细胞死亡。7天后 空白组出现大量死亡，14天后空白组细胞全部死亡，两个转染组大约有10％的细 胞存活，转染组细胞不再死亡，开始增殖，生长速度逐渐加快。传代后，细胞生 长旺盛，排列密集整齐，呈编织状旋涡状。 ’ blot结果：采用ChM—I／GAPDH 对照组与空白组间无统计学意义P0．05。Western 灰度比值作为评定指标，实验组、对照组和空白组ChM_I／GAPDH灰度比值的平均 和空白组间具有统计学意义(PO．05)，对照组与空白组间无统计学意义(P 0．05)。结果提示：实验组中的ChM-I在mRNA水平和蛋白水平上的表达均明显高 于对照组和空白组。 结论： G418的筛选培养基稳定筛选，最终建立ChM-I稳定上调表达的MSCs细胞株，为进 一步开展ChM-I诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化，构建组织工程软骨相 关研究打下基础。 关键词：软骨调节素一I MSCs软骨生物因子 2 Establishmentoftheratbone stemcelllines mesenchymal ChM·-I stablyexpressing Master degree candidate：Zhoulianzhong Supervisor：Prof．ZhaiLijie