β-葡聚糖酶产生菌的选育、发酵条件优化及酶纯化的的分析研究.pdfVIP

13l一葡聚糖酶产生茵的选育、发酵条件优化及酶纯化的研究 摘要 p一葡聚糖酶作为添加剂己应用于饲料和啤酒工业中。p．葡聚糖酶 作为生物活性多糖的改良剂及分析组成与结构的工具酶，也得到了 广泛应用。另外，近年来发现p．葡聚糖酶在植物的防病和抗病中也 具有非常重要的作用。 本论文通过平板初筛和摇瓶复筛，从土壤中筛选出一株D一葡聚 糖酶产生茵MT-7，并发现其具有分解代谢物阻遏效应。经过形态学 和分子生物学鉴定，该菌株为烟曲霉(彳职训螂扣所和觚)。 对菌株MF7进行原生质体诱变，发现该菌株原生质体最佳制备 条件为：原始菌株培养14h，以纤维素酶、溶菌酶和蜗牛酶质量体 积比5：3：2的比例配制复合酶液，在30℃条件下酶解3．5h，可得原 生质体6．8x107个／mL。以90s为紫外照射时间，经诱变选育后，突 变菌株Uv-26的酶活提高到3．4I胁I，，比原始菌株MT-7提高了2．25 I『／mI，，提高了1．96倍。 对突变菌株Uv-26培养基组分进行单因素实验和正交优化实 验，发现最佳组成为(％，w～)：茯苓粉3．O，麸皮2．O，酵母膏1．2， 脲O．3，KH2P04 O．1，FeS04·7H20O．1，无水CaCl2 O．2，MgS04·7H20 O．5。最佳发酵条件为：种子培养时间为24 h，初始pH为4．O，培养 温度为30℃，接种量为3％，装液量为50IIlL／250ⅡlL，转速为160 r／min，培养时间为72h。经过培养基组分和发酵条件优化后，菌株 Uv-26的酶活由原来的3．4I№I．提高到6．5lI，／mI，，提高了O．91倍。 菌株UV-26经过乙醇分级沉淀、透析浓缩和离子交换层析，得 到电泳纯的p．葡聚糖酶，通过变性凝胶电泳和非变性凝胶电泳结果 推测：纯化出来的p一葡聚糖酶是一个等分子量双亚基结构的聚合体， 分子量约为200 I①a。纯化后的p一葡聚糖酶酶活回收率为28．7％， 纯化倍数为24倍。 纯化的p一葡聚糖酶最适反应pH值为6．O、pH稳定范围为 5．O～7．O，最适反应温度为55℃，在低于50℃时，酶活具有较好的稳 定。Ca2+有一定的促进作用，Fe2+对该酶具有部分抑制作用，Fe3+和 №2+则具有明显的抑制作用，H92+对p一葡聚糖酶具有强烈的抑制作 Km值为159．98舭，最大反应速率Vm值为4．51m酌nL．min。 关键词：p一葡聚糖酶 烟曲霉 原生质体 离子交换层析 电泳 酶学性质 Ⅱ BREEDINGANDCONDITIONOPTIMIZATION OFA STRAIN AND PI爪IFICATIC}N p—GLUCANASE ABSTRACT has in been印plied indus缸y p—glucanase feed砌【ust叫狮dbrewing as me ofbioactiVe additiVe．As regarded improVer polysaccha—de， hasalsobeenuSedin s．咖cture p—glucallase composition距danalysis勰 has foundto an tool been