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遗传学幻灯12的

;第一节 基因工程概述 遗传工程广义:细胞工程、染色体工程 细胞器工程、基因工程 酶工程、发酵工程 狭义:基因工程 基因工程概述 基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。 ;→1982年经美国食品及药物管理局批准 ,采用基因工程方法在细菌中表达生 产的人的胰岛素进入市场,成为基因 工程产品直接造福于人类的首例 →1985年转基因植物获得成功 →1996年克隆羊诞生。 →现在,人类已利用这一技术改造和创 建新的生命形态、生产药品、疫苗、 牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病。 ;基因工程的基本步骤: 1. 目的基因的分离或合成 2. 将目的基因与载体DNA连接,构建重 组DNA分子-表达载体 3. 将重组DNA分子导入受体细胞,并获 得具有外源基因的个体 4. 转基因生物的检测与鉴定 5. 转基因生物的安全性评价 ;第二节 基因的分离 基因分离(克隆)包括3个步骤: 1. 目标DNA片段(基因)的分离 2. 目标基因克隆到载体上 3. 载体导入宿主细胞并在其中 大量复制 ;一、工具酶 1、限制性内切核酸酶 限制酶:作用于特定(异)核苷酸序 列的磷酸二脂酶 Ⅰ型酶:仅EcoB和EcoK两种,催化限制 性切割和修饰核苷酸2种功能 Ⅱ型酶:基因工程中应用最广泛 Ⅲ型酶:具有特异的识别位点,识别位 点是非对称的 ;Ⅱ型限制性酶的基本特性: ① 有特异识别和切割的序列部位 ② DNA分子上两个单链断裂的部位通 常不是直接相对的 ③ 断裂所形成的DNA片段常具有碱基 互补的单链尾巴(粘性末端) ④ 内切酶的切割和修饰功能由两个 不同的酶催化所完成,即内切酶 活性和甲基化作用活性是分开的 ;限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接 ; 图12-1通过用相同的限制性内切酶切割 形成一个重组DNA分子 ;限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点 ;2、DNA连接酶 DNA连接酶:重组DNA分子构建必不可少的工具酶,能催化DNA中相邻的3’ –OH和5’ – 磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来; 3、反转录酶 一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶,故又称依赖于RNA的DNA聚合酶 通常用反转录酶构建cDNA文库(cDNA library) ;4、聚合酶链式反应(PCR) PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明, 1993年诺贝尔化学奖 PCR可对特定DNA片段进行扩增,且可用痕量DNA作模板,对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝 ; PCR反应混合液四种主要成分: 两个引物(一般为20 bp) 模板DNA 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶,在 95℃甚至更高温度下活性稳定) 四种脱氧核苷酸。 PCR反应在PCR仪上自动进行;PCR反应从启动到结束称为一个循环, 每个循环包括三个步骤: 1)变性:95℃,DNA 双链分离成单链 2)退火(复性):55℃ 左右,引物与单链的 模板DNA序列互补结合 3)延伸:72℃左右, Taq酶通过在引物 的3’-OH端增加碱基的 办法使引物延伸;表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系;二、载体 载体:将外源基因送入受体细胞的工具 载体类型:细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等 载体特点: ① 在宿主细胞中能独立复制,即本身为复制 子,有独立的复制起始位点 ② 有限制酶切位点,允许外源基因插入且插 入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增 ③ 有选择标记,便于选择含重组DNA分子的 寄主细胞 ④ 分子量小,多拷贝,易于操作 ⑤ 具有安全性等; (1)细菌质粒:广泛应用于基因工程 ;Ti质粒及其衍生载体 Ti质粒包括五个区域 1. LB与RB之间的T-DNA,这段序列整 合到植物基因组中 2. 质粒转移区(PT) 3. 冠瘿碱代谢区 4. 复制原点 5. 毒性区(Vir) ;→T-DNA区域内的所有基因与转移无关,所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后,将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域,形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。 →Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的,毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。;Ti质粒的衍生载体,广泛用作植物基因工程中的载体: (1)双元载体(binary vectors) 如

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