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遗传学幻灯12的
;第一节 基因工程概述
遗传工程广义:细胞工程、染色体工程
细胞器工程、基因工程
酶工程、发酵工程
狭义:基因工程
基因工程概述
基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。 ;→1982年经美国食品及药物管理局批准
,采用基因工程方法在细菌中表达生
产的人的胰岛素进入市场,成为基因
工程产品直接造福于人类的首例
→1985年转基因植物获得成功
→1996年克隆羊诞生。
→现在,人类已利用这一技术改造和创
建新的生命形态、生产药品、疫苗、
牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病。 ;基因工程的基本步骤:
1. 目的基因的分离或合成
2. 将目的基因与载体DNA连接,构建重
组DNA分子-表达载体
3. 将重组DNA分子导入受体细胞,并获
得具有外源基因的个体
4. 转基因生物的检测与鉴定
5. 转基因生物的安全性评价 ;第二节 基因的分离
基因分离(克隆)包括3个步骤:
1. 目标DNA片段(基因)的分离
2. 目标基因克隆到载体上
3. 载体导入宿主细胞并在其中
大量复制 ;一、工具酶
1、限制性内切核酸酶
限制酶:作用于特定(异)核苷酸序
列的磷酸二脂酶
Ⅰ型酶:仅EcoB和EcoK两种,催化限制
性切割和修饰核苷酸2种功能
Ⅱ型酶:基因工程中应用最广泛
Ⅲ型酶:具有特异的识别位点,识别位
点是非对称的 ;Ⅱ型限制性酶的基本特性:
① 有特异识别和切割的序列部位
② DNA分子上两个单链断裂的部位通
常不是直接相对的
③ 断裂所形成的DNA片段常具有碱基
互补的单链尾巴(粘性末端)
④ 内切酶的切割和修饰功能由两个
不同的酶催化所完成,即内切酶
活性和甲基化作用活性是分开的 ;限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接
;
图12-1通过用相同的限制性内切酶切割
形成一个重组DNA分子 ;限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点
;2、DNA连接酶
DNA连接酶:重组DNA分子构建必不可少的工具酶,能催化DNA中相邻的3’ –OH和5’ – 磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来; 3、反转录酶
一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶,故又称依赖于RNA的DNA聚合酶
通常用反转录酶构建cDNA文库(cDNA library) ;4、聚合酶链式反应(PCR)
PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明, 1993年诺贝尔化学奖
PCR可对特定DNA片段进行扩增,且可用痕量DNA作模板,对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝
;
PCR反应混合液四种主要成分:
两个引物(一般为20 bp)
模板DNA
热稳定的DNA聚合酶(Taq酶,在
95℃甚至更高温度下活性稳定)
四种脱氧核苷酸。
PCR反应在PCR仪上自动进行;PCR反应从启动到结束称为一个循环,
每个循环包括三个步骤:
1)变性:95℃,DNA
双链分离成单链
2)退火(复性):55℃
左右,引物与单链的
模板DNA序列互补结合
3)延伸:72℃左右,
Taq酶通过在引物
的3’-OH端增加碱基的
办法使引物延伸;表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系;二、载体
载体:将外源基因送入受体细胞的工具
载体类型:细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等
载体特点:
① 在宿主细胞中能独立复制,即本身为复制
子,有独立的复制起始位点
② 有限制酶切位点,允许外源基因插入且插
入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增
③ 有选择标记,便于选择含重组DNA分子的
寄主细胞
④ 分子量小,多拷贝,易于操作
⑤ 具有安全性等; (1)细菌质粒:广泛应用于基因工程
;Ti质粒及其衍生载体
Ti质粒包括五个区域
1. LB与RB之间的T-DNA,这段序列整
合到植物基因组中
2. 质粒转移区(PT)
3. 冠瘿碱代谢区
4. 复制原点
5. 毒性区(Vir) ;→T-DNA区域内的所有基因与转移无关,所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后,将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域,形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
→Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的,毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。;Ti质粒的衍生载体,广泛用作植物基因工程中的载体:
(1)双元载体(binary vectors)
如
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