PUMCHCL-P-3-Q01-1双向电泳标本处理与纯化处理.docVIP

中心实验室实验指南 双向电泳标本处理与纯化 作者：郭丹 修订日期：2014-9-16 【目的及应用】： 双向电泳细胞/组织等样本的前期处理、纯化和定量。 【试剂及设备】： 1. 试剂 （1） PBS （2） 2D 裂解缓冲液 （3） 2D clean-up 纯化蛋白试剂盒 （4） 2D Quant 蛋白定量试剂盒 2. 设备：低温高速离心设备、振荡器、酶标仪、超声破碎仪 【实验步骤】： 1.样本处理计纯化 1.1 细胞样本处理 （1）培养细胞的收集：以胰酶消化细胞，反复吹打使其脱落，离心收集细胞(室温，1000g， 2min)； （2） 用磷酸缓冲液(PBS)洗细胞 3 次(室温，1000×g， 2min)； （3） 将细胞分装到 1.5ml Eppendorf 管中，吸干残留的 PBS； 6 （4） 加入裂解缓冲液(1.5x10 个细胞大约加入 100μL 裂解液)，在室 温振荡 1h，使其充分溶解； （5） 4°C，12,000×g，离心 0.5~1h； （6） 吸取上清以2D clean-up试剂盒进行蛋白纯化，或保存在-80°C备用。 1.2 组织样本处理 编号：PUMCHCL-P-3-Q01-1 北京协和医院中心实验室 更新日期：2014/09/11 第 1 页 ,共 5 页 中心实验室实验指南 对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用 的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白质的方法。 取材； 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g 样品加入0.5ml 裂解液，使用组织匀浆器 匀浆30 s，进行超声裂解60 s； 将组织悬液4℃，13 000×g 离心10 min； 取上清液，4℃，13 000×g 离心1h； 取上清以2D clean-up试剂盒进行蛋白纯化，或保存在-80°C备用。 1.3 样本纯化 蛋白质样本在 1.5ml 微型离心管中处理，如不特殊说明，所有步骤均应在冰浴上进行。 将体积 1~100μl 的蛋白质样本(含 1~100μg 蛋白质)置于 1.5ml 微型离心管中； 加入 300μl 沉淀剂 Precipitant，在振荡器上充分混匀 20s。冰浴中(4~5℃)15 分钟； 加入 300μl 共沉淀剂 Co-Precipitant，振荡混匀 20s； 将离心管置于微型离心机中，离心管的盖轴向外。以 13 000×g，4℃离心 5 分钟。离心完成 后立即将离心管取出。此时管中应可见小沉淀； 应立即进行下一步以防止沉淀再溶解或播散开。轻轻以 200μl 枪头吸去上清，不要搅散沉 淀； 将离心管的盖轴和离心沉淀向外，再次离心 30s，使残余液体沉降至管底，用移液管将残余 的上清液移去，这时管中应看不见任何液体成分； 保持沉淀不变，在其上面加入 40μl 共沉淀剂 Co-Precipitant，冰浴 5 分钟； 将离心管小心地置于微型离心机中，离心管的盖轴向外，13 000×g，4℃离心 5 分钟。用移 液管小心移去上清液； 在沉淀中加入 25μl 去离子水，振荡 5~10 秒，使沉淀散开，但并未溶解于水中； 在管中加入 1ml 洗涤缓冲液 Wash Buffer (在-20℃下至少预冷 1 小时)和 5μl 洗涤添加剂 Wash Additive，充分振荡直至沉淀完全散开，使溶液呈现云雾状。此步洗涤至关重要，是 去处杂质的重要步骤； 将管在-20℃下培育至少 30 分钟，每 10 分钟振荡 20~30 秒。在这种状态下，管子可以在-20℃下储存最多一周，其蛋白质发生降解或修饰的可能性最少； 13 000×g，4℃离心 5 分钟； 编号：PUMCHCL-P-3-Q01-1 北京协和医院中心实验室 更新日期：2014/09/11 第 2 页 ,共 5 页 中心实验室实验指南 迅速地倾倒上清并将离心管倒置于滤纸上，可见白色沉淀，室温下干燥 5~10min，注意不 要过度干燥沉淀，否则再溶解就会很困难； 用 50~100μl 水化液溶解沉淀，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。如果 沉淀过大或过干，再溶解会比较困难。用超声波处理或用样本研磨试剂盒处理可加速再溶 解； 进行蛋白定量并同时 13 000×g，4℃离心 30 分钟，去掉所有不溶物质和泡沫，直接进行水 化上样；或者进行定量后保存在-80°C，在样本水化上样前 13 000×g，4℃离心 30 分钟， 尽可能去处样本中的不溶物。 蛋白定量 2D Quant 蛋白定量试剂盒组成 ：沉淀剂、辅助沉淀剂、铜溶液、比色剂 A、比色剂 B、 牛血清白蛋白(BSA)标准溶液 2mg/ml 所需条件 ：微型离心设备、1.5ml 离心管、振荡器、酶标仪，96 孔板 准备注意事项 ：开始操作前，先制备工作比色剂，