肝星状细胞和肝细胞微载体共培养对肝细胞生物学特性影响实验地研究.docxVIP

福建医科大学硕士学位论文培养方法共培养人原代培养肝细胞与肝星状细胞系Ｌ１９０，结果表明Ｐ４５０活性较肝细胞单独培养时增强，并观察到肝星状细胞系Ｌ１９０在肝细胞间充填，推论星状细胞对肝实质细胞有重要支持作用。虽然体外培养的肝细胞，通过与肝非实质细胞共培养，可以表达更好的肝细胞功能、生长周期也有所延长，但普通单层培养单位体积内的肝细胞培养量却十分有限，肝细胞取用困难，且肝细胞功能及维持时间仍不能满足肝细胞移植及生物型人工肝的需求。本实验在肝细胞与肝星状细胞共培养的同时，结合微载体贴附悬浮培养。了解能否在培加单位体积肝细胞培养量的同时，获得更好的肝细胞功能表达。并迸一步延长体夕｝培养肝细胞的生长时间，探讨可用于生物型人工肝及肝细胞移植的肝细胞培养技术．５福建医科大学硕士学位论文材料和方法一、实验动物６～８周龄雄性Ｓｐｒａｇｕｒｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠（购自中国科学院上海实验动物中心），体重１８０～２４０９，平均体重２１６．６７士２４．７７９?大鼠饲养保持室温２０℃～２５＂１２、清洁环境，喂饲标准饲料，维持１２ｈ昼夜节律。术前１２ｄ＇时禁食。遵守实验动物使用及管理原则。二、主要实验试剂及仪器ｒＨＳＣ．９９细胞株微载体ｃｙｔｏｄｅｘ－３（球径１４１～２１１ｗｎ）台盼蓝Ⅳ型胶原酶ＤＭＥＭ干粉ＰＢＳ干粉胎牛血清安定标准品Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液Ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡＰＡＳ糖原染色试剂盒福建医科大学附属第一医院腹部外科研究所翁山耕副教授惠赠瑞典Ａｍｅｒｓｈａｍ美Ｉ雪Ｓｉｇｍａ公司美Ｉ萤Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司美国Ｇｉｂｅｏ公司美国Ｇｉｂｅｏ公司美Ｉ雪Ｈｙｅｌｏｎｅ公司中国药品生物制品检定所北京清大天一生物有限公司美国Ｓｉｇｍａ公司福州迈新生物技术开发公司ＴｒｉＺｏｌＲＮＡ提取试剂盒美国Ｇｉｂｃｏ公司Ｎａｐｅ０５４１０型Ｃ０２培养箱Ｏｌｙｍｐｕｓ倒置相差显微镜ＩＸ７０Ｏｌｙｍｐｕｓ数码相机Ｃ７０７０ＷｚＢＣＭ．１０００型超阶级净工作台低速大容量离心机ＤＬ－５电热恒温水浴锅Ｐｒｏｓｐｅｒｉｔｙ电热鼓风干燥箱ＣＬ．８００全自动生化检测仪显微外科手术机械６美ｍＮａｐｅｏ公司日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司中国江苏中国上海上海跃进医疗器械厂中国江苏日本岛津中国上海福建医科大学硕士学位论文三、实验方法及步骤（一）ｒＨＳＣ．９９细胞株培养冻存的肝星状细胞株复苏后，接种在２５ｃｍ２培养瓶内，含链霉素１００）．Ｌ＃ｍｌ、青霉素１００１Ｗ／ｍｌ和１０％胎牛血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｏｎｌｍ，ＦＢＳ）能ｊＤＭＥＭ为培养液，５％Ｃ０２、３７＂（２、９５％潮湿空气的Ｃ０２培养箱培养，２４ｈ后换培养液，以后每２～３ｄ更换１次培养液。共培养前用０．４％台盼蓝拒染法狈ｔ．ＩＨＳＣ活率，并将ＨＳＣ调至１．０ｘ１０％ｅｌｌｓ／ｍｌ备用。活率９０％以上的肝星状细胞用于后继实验。（＝）ＳＤ大鼠原代肝细胞分离ｌ、试剂配制及培养器具预处理（１）肝脏灌注缓冲液及胶原酶缓冲液的配制：见表ｌ。（２）２．５％ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ配制：２．５９ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ用无水乙醇溶解，剧烈振荡，３７＂１２孵箱过夜，使其完全溶解，然后加无水乙醇至１００ｍｌ，分装备用。（３）ＤＭＥＭ培养液的配制：ＤＭＥＭ粉１袋，双蒸水磁力搅拌器混匀溶解，配至１０００ｍｌ，调整培养液ｐＨ值为７．２，用０．２２肛ｒａ无菌过滤膜过滤灭菌，４＂Ｃ保存。培养细胞前配成含胰岛素０．Ｓｍｇ／Ｌ、谷胺酰胺３９／Ｌ、地塞米松１０—７ｍｏｌ／Ｌ、链霉素１００肛ｇ／ｍｌ、青霉素Ｇ１００ＩＵ／ｍｌ、１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ为培养液。（４）微载体的预处理：按产品说明书操作，１０００ｍｇＣｙｔｏｄｅｘ?３加入１００ｍｌ已硅化玻璃瓶中，加１００ｍｌ新鲜ＰＢＳ缓冲液水化至少４小时或过液，换ＰＢＳ液洗涤３次，再换新鲜ＰＢＳ缓冲液５０ｍｌ浸泡过夜，高压灭菌，４＂Ｃ保存备用。（５）培养瓶硅化及培养前准备：分离细胞前２天，培养瓶用２．５％ｐ０１ｙ－ＨＥＭＡ浸泡硅化，超净台过夜风干，高压灭菌。分离细胞前１天，灭菌ＰＢＳ洗涤３次，加入含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液，Ｃｙｔｏｄｅｘ－３按３ｅｄＬ加入，３７＂Ｃ孵箱过夜。（６１玻璃器皿的硅化：培养瓶以外所有与微载体接触的吸管、培养皿等玻璃器皿均用２％－－氯二甲基硅烷硅化。２、半原位胶原酶灌注消化法分离大鼠肝细胞：按Ｓｅｇｌｅｎｌ６１报道的方法加以改良，雄性ＳＤ大鼠，乙醚吸入麻醉，仰卧固定于操作台上，胸腹部消毒，肝素钠１０００ｕ腹腔内注射肝素化，开腹，门静脉近肝处插硅胶管针头，丝线固定，３７℃无钙镁的肝脏灌洗缓冲液循环灌流，流速２０ｍｌ／ｍｉｎ，见肝脏胀大、下腔静脉充盈，剪断下腔静脉。待肝脏变为均土黄色后，取下大鼠肝脏，置于１０ｃｍ培养皿中，７福建医科大学硕士学位论文移至超净工作台，注意保持门静脉置管完好，经门静脉