SARS冠状病毒核衣壳蛋白对细胞色素氧化酶CYP450(CYP4F3A)酶活性影响的分析研究.pdfVIP

SARS 冠状病毒核衣壳蛋白对细胞色素P450(CYP4F3A)酶活性影响的研究 摘 要 SARS 冠状病毒核衣壳蛋白对细胞色素氧化 酶CYP450(CYP4F3A)酶活性影响的研究 摘 要 核衣壳蛋白（N 蛋白）是SARS 冠状病毒(SARS-CoV)的主要结构蛋白之一， 与病毒RNA 结合形成核衣壳，能够诱导强烈的细胞免疫和体液免疫，在 SARS 的诊断和预防上具有重要的应用。与其它冠状病毒 N 蛋白不同，SARS-CoV N 蛋白定位于细胞质，参与SARS 冠状病毒RNA 合成的调控以及核衣壳的形成。 并且，SARS-CoV N 蛋白能结合人亲环素(hCypA)解离病毒核心，激活AP-1 信号 转导途径，从而干扰宿主细胞分裂，在生长因子缺乏的情况下诱导细胞凋亡。前 期工作发现 N 蛋白可能在 SARS 冠状病毒感染过程中起重要作用。为了研究 SARS-CoV N 蛋白参与炎症反应的分子机理，以全长N 蛋白为诱饵蛋白，利用 酵母双杂交筛选人胎肝 cDNA 文库时，发现细胞色素 P450 （CYP4F3A ）与 SARS-CoV N 蛋白相互作用。CYP4F3A 是炎症反应过程中重要的调节蛋白，其 相互作用很可能与SARS 病毒的致病性相关。 本研究建立了CYP4F3A 在体外的酶促反应体系及其动力学常数测定方法， 并通过一系列离子交换层析、分子筛凝胶过滤层析、免疫沉淀、免疫印迹以及 ELISA 证明，SARS-CoV N 蛋白与CYP4F3A 结合可以抑制CYP4F3A 的ω-羟化 酶活性，从而抑制炎症因子LTB4 的降解。N 蛋白在体外抑制CYP4F3A 的酶活， 使其Km’值从2.5µmol/L 变为10.2µmol/L，而加入229E N 蛋白后Km’仅变化为 4.82µmol/L 。我们发现通过尾静脉注射N 蛋白在LPS 诱导小鼠炎症模型中起促 进炎症反应的作用。Silybin 是从植物水飞蓟中提取的黄酮类化合物，具有抑制 5-酯氧酶的作用，从而间接阻断了LTB4 的合成。当在LPS 注射前 1h 给予药物 Silybin，LTB4 浓度比未给药组低。说明Silybin 可以通过阻断炎症介质的生成来 保护LPS 诱导产生的急性肺损伤。并且，当肌肉注射表达N 蛋白的质粒并腹腔 注射LPS 的小鼠血清中LTB4 水平与对照组相比升高。将质粒与MDP-C （胞壁 I SARS 冠状病毒核衣壳蛋白对细胞色素P450(CYP4F3A)酶活性影响的研究 肽佐剂）一起通过静脉免疫家兔，动物产生显著的过敏样反应。小鼠和家兔肺部 及肠道中性粒细胞浸润，部分动物表现为肺水肿，这些症状与SARS 临床表现类 似。 本研究为SARS 致病机理的进一步研究提供了重要线索。 关键词：SARS-CoV N 蛋白；CYP4F3A ；LTB4 ；Cyp4f18 ；HCoV-229E N 蛋白； 酶促反应动力学；米氏常数；抑制常数；ELISA II ABSTRACT The effects of SARS-CoV nucleocapsid protein on the catalytic activity of Cytochrome P450(CYP4F3A) Abstract Nucleocapsid protein is one of the major structural proteins of SARS-CoV， Which is known to bind viral RNA to form the helical n