嗜线虫沙雷氏菌金属蛋白酶的分离纯化、理化活性分析研究及基因克隆.pdfVIP

中文摘要 嗜线虫沙雷氏菌金属蛋白酶的分离纯化、理化活性研 究与基因克隆 摘要 蛋白水解酶(proteolytic 白质分子内部肽键，使蛋白质分子变成小分子多肽或氨基酸的内切(肽)酶，蛋白水 解酶在工农业和医药生产上有着广泛的应用，是目前医药行业中应用最广的一类酶。 蛋白酶是zn2十金属蛋白酶，金属蛋白酶分布广泛，性质特异，具有重要的应用价值。 目前主要应用于食品、洗涤剂、化妆品、杀虫剂及抗肿瘤药物的开发和疾病的机理研 究等方面。由于金属蛋白酶来源有限，限制了金属蛋白酶的进一步发展，所以研究微 生物金属蛋白酶，利用微生物发酵生产金属蛋白酶具有重大的现实意义。 嗜线虫沙雷氏茵(Serratia 小杆线虫(Heterorhabditidoides 共生菌新种。本试验AKSerratia G一75凝胶过滤、DEAE． 得到一种金属蛋白酶，属于锌离子金属蛋白酶。经_Sephadex Fast Flow离J子交换层析、Resource Sepharcyl Q中压液相层析分离得到电泳纯的蛋白。 kDa。 通过还原与非还原SDS．PAGE电泳表明该蛋白为单链分子，相对分子质量约为50 该菌能在以酪蛋白为底物的蛋白酶检测固体培养基上形成明显的水解晕圈，证明 该菌株具有较强的蛋白酶水解酶活力。通过酶活性检测结果表明，纯化的蛋白具有酪 蛋白水解酶活性。同时，通过分析用Edman降解法得到的N一端15个氨基酸序列， marcescens 发现与来源于粘质沙雷氏菌Serratia SM6和粘质沙雷氏菌Serratia marcescens marcescens E15以及粘质沙雷氏菌SerratiaHR．3的金属蛋白酶N一端15个 氨基酸序列具有较高的相似性，进一步证明了该蛋白是金属蛋白酶。根据N一端测序 结果和同源，胜分析设计了一对引物，采用PCR技术扩增得到1500bp左右的产物，然 后插入到PMDl8．T载体中并转化到大肠杆菌中，对得到的阳性克隆测序。测序结果 显示，该片段长1398 bp，编码465个氨基酸残基。分析发现克隆翻译得到氨基酸序 列与N～末端测序结果相吻合，得到一个完整的成熟肽序列。该基因序列与报道的粘 质沙雷氏菌SM6菌株的金属蛋白酶基因的同源性达到98％，与沙雷氏茵HR．3菌株金 属蛋白酶基因的的同源性也达到97％，推导的成熟肽氨基酸序列与粘质沙雷氏菌SM6 菌株和沙雷氏菌HR-3菌株的金属蛋白酶成熟肽同源性都达到98％。该成熟肽片段包 括470个氨基酸残基，预测等电点为pI4。57，相对分子质量为50642．92Da。 嗜线虫沙雷氏菌金属蛋白酶的分离纯化、理化活。陛研究与基因克隆 通过研究证实：该菌株在LB培养基和加有酪蛋白的基础盐培养基中分泌的胞外蛋 白酶活力在对数期随着细菌浓度的增大不断增强，在对数生长末期约30h蛋白酶活性 达到最大，而该菌株在无蛋白质和氨基酸的基础盐培养基中培养50h都未检测到胞外 蛋白酶活性物质。通i：立．Serratia nematodiphila在不同培养条件下生长与产酶的比较确定 该菌株分泌的胞外蛋白酶为诱导型表达。 本实验在证明了该蛋白是金属蛋白酶的基础上，进一步研究了纯化的金属蛋白酶 的一些酶学性质。动力学方法测得该金属蛋白酶能适应较宽的pH值范围，该酶在 6．0．11．O的pH值范围内稳定，最适pH值为8．0，该酶在43℃以下的温度范围内稳定，最 适温度35℃。以酪蛋白为底物的Km值为6．10 mg／mL。该酶对各种有机溶剂都有较强 的耐受性，但甲醛对酶活性的影响较大，对非离子表面活性剂敏感。 等金属离子在低浓度时对酶的活性有不同程度的促进作用。相对看