柑橘黄龙病LAMP快速检测方法建立及应用.docVIP

柑橘黄龙病LAMP快速检测方法建立及应用摘要：【目的】为了建立柑橘黄龙病菌亚洲种LAMP快速检测方法。【方法】根据黄龙病菌亚洲种外膜蛋白基因，在种属特异保守区域的6个位点设计2对特异性引物，对反应条件和体系进行优化，并通过产物沉淀观察和SYBR Green I荧光染料显色的方法来快速判读检测结果。同时对田间样品进行了特异性和灵敏度分析试验。【结果】该方法仅需63 ℃反应70 min即可得到结果，特异性强，灵敏度高。对柑橘常见病害样品进行LAMP扩增，仅HLB阳性样品扩增产物电泳呈特征性梯状条带。检测灵敏度比常规PCR高100倍，与实时定量PCR相当。在对105份黄龙病田间疑似样品检测中，LAMP阳性检出率为52.4%，常规PCR为37.1%，2种检测方法符合率为84.7%。【结论】建立的黄龙病菌亚洲种LAMP检测方法，快速简便、特异性强、灵敏度高，为快速检测柑橘黄龙病提供了新方法和新思路。 关键词： 柑橘黄龙病菌亚洲种； 外膜蛋白基因； 环介导等温扩增技术 柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing， HLB）是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一，是国内外植物检疫对象。目前主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区，中国19个柑橘生产省（市、自治区）中已有11个受到该病危害，严重制约柑橘产业的健康发展。其病原物暂定为α-变形菌纲韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter），包括亚洲种（Ca. L. asiaticus’）、非洲种（Ca. L. africanus’）和美洲种（Ca. L. americanus’）[1-2]，在我国该病害主要由亚洲种引起[3]。田间症状表现为病树的黄梢和叶片的斑驳型黄化，果实小，畸形，严重影响柑橘的品质与产量。由于目前缺乏有效药剂和抗病品种，主要采取砍除病树、防治木虱和种植无病苗木等防控措施，因此加强柑橘黄龙病的早期诊断显得尤为重要。传统的指示植物[4]、电镜[5]和血清学[6]等诊断方法不仅费时费力，而且效率低；近年，常规PCR[7]、巢式PCR [8]和实时定量PCR[9-10]已应用到柑橘黄龙病的检测上，但是 PCR 检测技术需要特殊仪器设备且检测成本较高，不适合在田间大规模快速应用，因此，在加强柑橘苗木检疫监测中，迫切需要一种成本低廉、操作简便、结果判断快速、灵敏度高和特异性强的柑橘黄龙病检测方法。 日本学者Notomi等[11]于2000年开发了一种新型的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification， LAMP）。该技术针对靶基因的6个特定区域设计4条特异引物，借助具有链置换作用的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在等温条件下进行靶序列高效扩增。它避免了常规 PCR 温度循环的特殊要求，因其简便、高效，成本低、检测周期短等优点，具有较高的应用价值。LAMP检测技术已广泛应用于临床、食品、农业等领域，目前在植物中主要集中在植物病毒、细菌、真菌性病害及转基因作物的检验检疫工作中[12-15]，具有较大的开拓空间。因此，我们主要运用LAMP技术，建立一种柑橘黄龙病的快速检测方法。 1 材料和方法 1.1 供试材料 从我国7省（市、区）收集黄龙病疑似样品，大部分由中国农业科学院柑桔研究所国家苗木脱毒中心田间调查采集，少量样品由现代柑橘产业体系综合试验站和各地植保植检系统工作人员提供，所有样品4 ℃保存备用。溃疡病、黑星病、炭疽病和褐斑病等柑橘病害的DNA模板在国家苗木脱毒中心实验室-20 ℃保存。 1.2 主要试剂 Bst DNA聚合酶购自北京纽英伦生物技术有限公司；氯化钾、硫酸铵和硫酸镁等购自Sigma公司；10000×SYBR Green I购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Trans1-T1 Phage Resistant 化学感受态购自北京全式金生物技术有限公司；Ssp I限制性内切酶、DNA标准分子量和PCR相关试剂购自Takara和Promega公司。 1.3 DNA的提取 利用CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA，提取方法参照Murray等[16]方法，样品-20 ℃保存备用。 1.4 LAMP引物的设计 根据NCBI公布的Ca. L. asiaticus’基因组的外膜蛋白基因保守序列（Genbank登录号：AY842429），利用PrimerExplorer V4在线软件（http：//primerexplorer.jp/e/）在种属特异保守区域设计外引物对（F3和B3）和内引物对（FIP和BIP）；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。序列信息见表1。 1.5 LAMP反应体系和反应条件