一种小尾寒羊胚胎玻璃化方法在胚胎移植中的应用.docVIP

一种小尾寒羊胚胎玻璃化方法在胚胎移植中的应用 　　摘要：实验目的：在小尾寒羊的畜牧业良种繁育中，探索液氮气相存储技术应用于胚胎玻璃化冷冻的可行性。实验方法：采用小尾寒羊母羊作为胚胎的供体，利用超数排卵技术和体外输精之后，并且胚胎在供体羊体内发育的7天之后，将胚胎冲出。之后，利用新的玻璃化冷冻技术对所采集的胚胎进行冷冻处理，冷冻处理24小时之后复苏，之后移植同期发情蒙古母羊受体体内，并且以鲜胚移植同批发情母羊受体作为对照组。实验结果：玻璃化胚胎移植的妊娠率与胚胎的发育的不同阶段密切相关（fisher精确检验：p=0.01 8），CH（紧缩桑葚胚）的怀孕率显著高于BL（囊胚期）。实验结论：在气相液氮存储条件下，羊胚胎玻璃化冷冻采用紧缩桑葚期胚胎，能提高妊娠率。 　　关键词：胚胎移植；玻璃化；液氮蒸汽相存储；低温生物学 　　低温保存胚胎技术是优良种畜生育和种群扩大的重要组成技术。从1985年Rail和Fahv使用玻璃化冷冻法成功地冷冻了小鼠胚胎（RallFahv 1985）以来，玻璃化已成为常规的低温动物胚胎保存技术之一，广泛用于动物和人的胚胎保存中。玻璃化形成于-80℃--130℃，在这个转变温度以下，分子运动和化学转化都会停止，胚胎等生物样品可以无限期地保存，因此是种群保存、动物基因克隆建库、运输和胚胎移植等应用的有效手段（Woods，Benson，AgcaCritser，2004）。在当前的玻璃化冷冻技术中，胚胎等生物活性-样品通常被储存在液氮液体内，温度是-196℃，大大低于玻璃化形成所需要的温度，液氮液体存储具有价格低廉并普及的优点。然而，液氮蒸气相中同样可以实现低温样品的保存，被称为气相存储，目前已有很多商品化的液氮气相存储装置可供选择。液氮气相存储具有以下优点：1）可避免共处一个液氮池中的各样品之间发生潜在的相互污染以及防止传染介质在其中的传播；2）由于存储温度在-130℃--150℃，长期存储可以节约液氮的使用，从而降低成本提高经济效益；3）可以防止样品的碎裂现象发生，在玻璃化冷冻中有一个问题是碎裂，这通常发生在较大的样品中（mL体积以上），碎裂会发生在大幅低于玻璃体形成温度的以下温度，例如液氮液体温度（-196℃）。防止样品碎裂发生要求生物样品存储的温度保持在玻璃体形成温度以下10摄氏度到20摄氏度之内，例如：-130℃到-150℃之间，这就要求进行气相存储。我们设计并制作了一种恒定温度在-140.5℃的液氮气相存储装置，在此次试验中玻璃化冷冻小尾寒羊供体的胚胎，在本次实验证明有效，并申请了专利保护。 　　目前，对于在液氮气相玻璃化冷冻绵羊胚胎并应用于胚胎移植，报道和研究较少，我们设计进行这种玻璃化胚胎冷冻的试验，同时使用鲜胚移植作为阳性对照，以验证试验方法及试验过程的可靠性，探索液氮气相存储玻璃化冷冻在绵羊胚胎移植中应用技术。通过对小尾寒羊在气相液氮装置进行胚胎玻璃化冷冻，解冻后进行胚胎移植，为绵羊优良种畜生育和种群扩大探索新的低温技术，最终为胚胎移植技术的改进和低温冷冻设施的改良奠定基础。这对于绵羊的良种育种和良种扩大，都有很大意义。 　　1.材料与方法 　　1.1实验设计 　　以30只小尾寒羊作为供体以三种FSH（卵泡刺激素），分别为加拿大（Canada），宁波（Ningbo）和中科院（CAS）进行超排卵，并进行人工授精。120只蒙古羊同期发情作为胚胎移植受体。冲洗取出受精的胚胎，按形态学标准对胚胎分级。取50枚胚胎进行气相条件下玻璃化冷冻，并在自制的液氮气相装置中温度控制在-140℃过夜，24h后解冻，并且移植25只蒙古羊，每只羊移植两枚胚胎。作为对照组，以50枚新鲜采集的胚胎移植另外25只蒙古羊作为阳性对照组，同样每羊移植2枚新鲜采集的胚胎。 　　1.2气相液氮装置的制备： 　　所用装置按本实验进行设计和制作，存储空间为液氮的蒸汽相（气相），可以保证实现存储室的温度不超过-140.5℃的温度范围，有效克服气相冷冻装置温度变化大的缺点。进行验证后，此装置已被申请发明专利，发明名称：恒定低温存储系统及去除杜瓦雾气的方法。申请号为：CN201710024975.1 　　注：在过夜玻璃化冷冻所存储的胚胎中，x轴为时间从凌晨0：00到下午16：48的温度监控。Y轴为温度变化。如图所示：T Bottom为气相存储室底部的温度探头所检测到的温度，T Top为气相存储室顶部的探头所测温度，T Center为气相存储室中部的探头所测温度；以上温度探头均为OMEGA的热电偶，Tc为RTD类型的温度探头。Tset（PID）proportional-integral-derivative控制器作为本装置的控制单元。PID单元的控制温度加上一个补偿值来和实际温度相一致。 　　1.3主要药品： 　　羊用同期发