色谱柱不能反冲.pptVIP

高效液相色谱法 High performance liquid chromatography (HPLC) 教学大纲 熟悉HPLC法的基本原理 熟悉HPLC法的定义、特点 掌握HPLC法实验条件的选择 掌握HPLC法的定量分析方法 熟悉HPLC法分类及方法 教学大纲 了解HPLC色谱仪的构成 熟悉HPLC法分类及方法 掌握HPLC法的定义、特点 掌握HPLC法实验条件的选择 掌握HPLC法的定量分析方法 HPLC法的定义、特点 用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入进样阀的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。 二、特点 1.适用范围广（可分析80%有机化合物） 2.分离性能好 3.分析速度快 4.灵敏度高 5.色谱柱可反复使用 6.流出组分容易收集 HPLC实验条件的选择 HPLC前处理 色谱柱的选择 流动相的选择 洗脱方式的选择 检测器的选择 HPLC前处理 流动相的处理 HPLC前处理 样品的处理 供试品溶液的制备 色谱柱的选择 根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度 色谱柱的分类 正相色谱柱：固定相极性大于流动相，一般指硅胶柱，以正己烷系列为流动相。正相色谱法 主要用于分离分析能溶于有机溶剂的极性及中等极性分子型物质 色谱柱的分类 反相色谱柱：固定相极性小于流动相，其技术就是在硅胶基质上键合有机碳链。一般指C18、C8、苯基柱等，以甲醇、乙腈、水为流动相。 反相色谱法 适用于非极性及中等极性化合物 目前用的最多的色谱柱是反相键合相色谱柱 最常用：（octadecylsilane) ODS柱/C18 （十八烷基键合相） 避免压力和温度的急剧变化和任何机械震动 样品要进行预处理；在分析柱前安装保护柱（如分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解） 流动相要适宜，不能对固定相产生破坏 注意色谱柱的pH使用范围、耐压限度 注意色谱柱的方向性，色谱柱不能反冲（除非指明） 每次色谱分析完成后，要及时对色谱柱进行冲洗 保存色谱柱在合适的溶剂中（应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。） 流动相的选择 固定相一定时，流动相的种类、配比、pH值及添加剂等能显著影响分离效果，HPLC中流动相的选择至关重要。 对流动相的基本要求 ①不与固定相发生化学反应 ②对样品有适宜的溶解度 要求容量因子k在2～5 (最佳) 或1～10 (可用) k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀 ③必须与检测器相适应 例如用紫外检测器时避免末端吸收 ④粘度小 流动相的选择 反相键合相色谱 正相键合相色谱 反相离子对色谱 键合相的优点 ①使用过程不流失 ②化学性能稳定，在PH2-8的溶液中不变质 ③热稳定性好，一般在70℃以下稳定 ④载样量比硅胶约大一个数量级 ⑤适于作梯度洗脱 反相键合相色谱流动相的选择 1.部分含水溶剂：水为基础溶剂，再加入可与水互溶的有机极性调节剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃）。 适用于分离中等极性、弱极性药物。 常用甲醇－水、乙腈－水系统 有机极性调节剂的性质及其与水的比例对保留值和分离选择性有影响。 反相键合相色谱流动相的选择 2.缓冲溶液 常用的缓冲液：三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液。 适用于可溶于水并具可解离特性的化合物，如蛋白质及弱酸、弱碱类化合物。 缓冲液及PH不同、及所占比例不同会影响组分的保留值 注意 反相键合相色谱流动相的选择 3.非水溶剂 流动相为不含水系统。 用于分离疏水性物质。 在乙腈及甲醇中加入二氯甲烷或四氢呋喃。这种色谱法称为非水反相色谱法。 正相键合相色谱流动相的选择 流动相采用饱和烷烃（如正己烷）中加入极性较大的溶剂为极性调节剂（如异丙醚），通过调节极性调节剂的浓度来改变溶剂强度。 反相离子对色谱流动相的选择 是极性较强的水系统混合溶剂 最常用的是甲醇－水、乙腈－水中加入0.003-0.01mol/L的离子对试剂 离子对试剂的性质、浓度、流动相的PH及流动相中有机溶剂的性质和比例都会影响组分的保留值和分离效果 洗脱方式的选择 等度洗脱 梯度洗脱 洗脱方式的选择 1洗脱的类型 等度洗脱 在一个分析周期内流动相的组成保持恒定 适合于组分数目较少、性质差别不大的样品 思考题 中药制剂HPLC定量分析方法所需完成的内容？ * * HPLC法 一、定义 ????????????????????????????????????????????????? ??