第四章节 核酸电泳.ppt

RNA提取的通用方法 RNA提取常见问题 RNA降解 RNA降解 OD260 /OD280 比值偏低 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 RT常见问题分析和解决方案 RT常见问题分析和解决方案 RT常见问题分析和解决方案 4、DNA鉴定 DNA的鉴定 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定 浓度鉴定 1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度 A260×稀释倍数×50＝ μg/ml 紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。 2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng） 纯度鉴定 紫外分光光度法： 在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。 A260与A280之比应在1.80；纯的RNA A260与A280之比应在2.0。 A260/A280比值是纯度检测的重要指标。 完整性鉴定 凝胶电泳法： 基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。 琼脂糖电泳的用途 判断扩增片断的大小 回收扩增片断 用于转印进行Southern印迹 问题如何获得清晰的琼脂糖电泳照片呢？ 琼脂糖电泳结果的影响因素 凝胶 电泳液 电压 检测手段 琼脂糖凝胶浓度的选择 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比。 2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过20kb 。 3、不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度 /%???? 0.3????0.6???? 0.7???? 0.9???? 1.2???? 1.5???? 2.0线状DNA大小/kb??60-5??20-1??10-0.8??7-0.5??6-0.4??4-0.2??3-0.1 电泳缓冲液 DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。 缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性 常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE,其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。 电泳缓冲液比较 琼脂糖凝胶中DNA的检测 凝胶中核酸染色方法： 溴化乙锭(EB)染色法和SYBR Gold染色法 前者检测灵敏度低10ng，但价格便宜，常用 后者检测灵敏度高20pg，但价格昂贵，不常用 染料存在时，线状DNA电泳迁移率降低约15％ 在凝胶中没有EB时，DNA条带更为清晰，当需要知道DNA片断的准确大小时，可以在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色 染色方法：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中，室温下30-45min。染色完毕后通常不需要脱色。在检测小量DNA(10ng)时，需要脱色，具体方法为将染色后的凝胶浸入水中或1mmol/LMgSO4中，室温脱色20min 电压 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。 随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的DNA可以5-20 V/cm电压电泳 凝胶制备的注意事项 1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移，并可使临近孔泳带变斜） 2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长 3、EB含量要适当 4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，再熔化 5、检查梳子 6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度 7、凝胶稍厚些，避免样品溢出 电泳时间 PCR产物，应该在24h之内电泳 电泳时间不易过长，对于长片断影响不大，但对小片断DNA影响明显 电泳期间，EB向阴极迁移，与DNA迁移方向相反，长时间电泳将导致凝胶中EB含量显著较少，小片断DNA检测发生困难 电泳上样量 中号梳子：8—10ul 小号梳子：6—8ul 上样注意事项： 1、加样时应悬空 2、加样尽可能快 3、不必每一个样品用一个吸头 4、上样量中DNA含量过高，容易产生“弯月亮” 凝胶拍照 曝光时间：6--10s 拍照尺寸的选取：选用大的尺寸