Klebsiella+sp.601细菌漆酶基因的克隆、蛋白表达纯化及酶学性质的的分析研究.pdfVIP

摘要 漆酶(EC 1．10．3．2)是自然界广泛分布的多铜氧化酶家族中的一个成员，它 能氧化一大类酚及非酚类化合物。漆酶广泛存在与植物、昆虫和真菌中，目前在 细菌中也有发现。同植物及真菌漆酶比较，细菌漆酶可能比真菌漆酶有更多的优 点，如不需糖基化、热力学稳定性好，酶活最适pH广泛等。本实验室己从土壤 中筛选到的一株产漆酶菌Klebsiella sp．601，但产酶量较低，以致于不能直接从 细菌细胞内分离纯化细菌漆酶，更无法全面了解该细菌漆菌的酶学牲质。为克服 这一困难，本研究试图从glebsiella sp．601基因组中克隆出编码细菌漆酶的基因， 在大肠杆菌表达系统中大量表达，分离纯化获得纯酶并进行初步的酶学分析，为 后续开发利用细菌漆酶，或运用蛋白质工程的方法对该酶进行改良提高它的酶活 力或稳定性创建一个良好的平台。 本实验利用Blast搜索GenBank上的肠杆菌科多铜氧化酶，寻找保守氨基酸 序列，利用CODEHOP设计简并引物，以Klebsiella sp．601总DNA为模板进行 杂交的方法克隆出该菌编码漆酶的整个基因序列。通过Blast搜寻比对，克隆的基 因编码的酶蛋白与大肠杆菌CueO具有很高的同源性．相似性达90％，相同性达 coli 78％。与E CueO序列比较，一个明显的不同是Klebsiella sp．601漆酶氨基 酸序列在靠近C．端的部分即第400至420位氨基酸残基之|’日J多出20个氨基酸。 通过亚克隆将克隆的细菌漆酶基因插入到细菌质粒表达载体pET23a上，转化到 细菌宿主细胞BL21(DE3)plysS中进行表达。经一系列诱导表达条件摸索，使用 0．7mmol／I IPlG在37℃诱导4小时表达的效较佳。经Ni离子层析柱一步纯化， 即可获得纯净的酶蛋白。从lL细菌培养物中可纯化出4．32mg酶蛋白。对该酶 的酶学性质研究分析发现，Klebsiella sp．601细菌漆酶由536个氨基酸组成，分 仅为一0．133。 以DMP为底物时该酶的最适反应pH为8．0，以ABTS为底物时该酶的最适 反应pH为3．0，以SGZ为底物时该酶的最适反应pH为7．0，较佳的反应温度 为37℃。Klebsiella 条件下处理5小时仍能保持保持70％以上的相对酶活，在pill0．0强碱性条件下 求得Klebsiella 37。C条件下催化ABTS氧化的K。值为7．63mmol／L，knt值为7．85xl3s-1，l(ca,／Km 值为1．03x103mM。1 Klebsiella 催化DMP和ABTS氧化反应更有效。 关键词：妣据肋够601细菌漆酶，基因克隆，蛋白表达与纯化，酶动力学 ABSTRACT amemberof oxidascswhich L10．3．筋is the widely Laccuse(EC muticopper existinnature，and the reactionofa of and catalyzesoxidizing categoryphenol in the were found compounds．In plants，insects non-phenolic past，laccasesmainly and