Pseudomonas+putida+GM6聚磷相关基因的克隆和特性的分析研究.pdf

中文摘要 Pseudomonas GM6聚磷相关基因的 puffda 克隆和特性研究 中文摘要 水体富营养化是全球十大环境问题之一．氪磷尤其是磷的输入是引起水体富营养 化的关键因素。城镇生活污水的排放是水体磷污染的主要来源之一．为解决磷污染所 带来的危害，在污水进入水体前进行有效处理，降低排放污水的磷浓度十分殛要．目 前世界各地大规模污水处理厂主要采用强化生物除磷工艺(Enhanced biological phosphorus 济等特征。在EBPRg统中聚磷茵在磷的去除中起着至关重要的作用。为此，加大对 聚磷茵的聚磷特性、聚磷相关基因及聚磷茵的工程化应用进行研究十分，必要． 本文以高效聚磷茵聚磷机理研究为主线，以高效聚磷茵GM6为研究材料，系统 研究了高效聚磷茵的几个与聚磷相关的ppk基因，ppx基因．phoU基因和肋aZ基因 等．通过对这些基因进行克隆、表达和敲除失活来研究茵株在强化废水生物除磷工艺 中的作用，取得了大量关于污水强化生物除磷茵基因调控过程的基础研究成果。 一．PseudomonasputidaGM6的ppk基因的克隆和敲除以及除磷特性研究 运用SEFA-PCR的方法，从GM6中扩增出多聚磷酸盐激酶基因铆哟，预测其全长 为2220 KT2440的同源性为89％， bps，氨基酸水平比对发现与Pseudomonasputida Pseudomonas coli PAOli80％，Acinetobacter aeruginosa 000 K12．MGl655为33％。通过构建同源重组载体，经两次同源重组获得了失去中问约1 bps掣Jppk突变株． 将突变株和原始菌株分别接入低磷培养基和合成废水中进行好氧培养．发现在同 等初始0D值下，单位干重菌株所吸收的磷在重量上并无显著差异；而当初始OD值不 相等时，OD渔越大每毫克细胞干重所吸收的磷反而越少．用poly-P染色法对处于好氧 培养状态的突变株和原始菌株分别染色，结果发现在同等的条件下，用染色方法无法 观察到突变株茵体内有poly．P的存在，而却能在原始茵株中观察到．由于口酞基因参与 催化合成长链多聚磷酸盐的，由第二个础基因妇t2)来催化合成的短链多聚磷酸盐在 胞内磷酸盐积累过程中可能也发挥着重要的作用． 二．PseudomonasputidaGM6的ppx基因的克隆和敲除以及除磷特性研究 根据克隆耻基因的方法AKGM6中克隆到它的下游基因序列多聚磷酸酯酶基因 妇x)，该基因与pp七基因的转录方向相反．ppx长为1500bps，编码500个氨基酸，以ATG 作为起始密码子，UGA作为终止密码子。发现其氨基酸与Pseudomonas fluorescens KT2440为84％，Pseudomonas PfO·l的同源性为88％，只putida syringaepv．syrhxgae B728a为83％．根据敲除耻基因的方法设计两同源臂，最后获得失去中间约500bps的 ppx突变株． 将突变株和原始菌株分别接入低磷培养基乖合成废水中进行好氧培养．结果发 现，初始OD值相等时每毫克细胞干重所吸收的磷含量基本无差别，除磷效率并无明 显差异，生长幅度也基拳相同；但是，当初始OD值不相等时，每毫克细胞干重所吸 收的磷含量与初始OD值的大小成反比．通过poly-P染色后发现，原始菌株和突变株 均能观察到poly-P