第20章 比色法和分光光度法chapter20_479101053.ppt

实例2：环糊精增敏4-羟基香豆素衍生荧光法测定肉制品中痕量亚硝酸盐。 在酸性溶液中，NO2-能与过量4-羟基香豆素形成低荧光衍生物—3-亚硝基- 4-羟基香豆素，该产物经Na2S2O3还原为3-氨基- 4-羟基香豆素，此还原产物在碱性条件下发射较强荧光。如果有?-环糊精存在，由于?-环糊精对发光体的包络作用，使荧光强度大大增强。 激发波长332nm，发射波长457nm。 线性范围：1-1200ng NaNO2/25mL。检测下限：40pg/mL。 作 业 p326: 2, 4, 7, 10 p333-334: 1，3，5 p392：1 p393：4，6 p393：10，12 p394：18, 20, 25 p413: 3, 6 第二十章 比色法和分光光度法 20.1 概述 20.2 光吸收定律 20.3 比色法和分光光度法及其仪器 20.4 显色反应与显色条件的选择 20.5 分光光度法仪器测量误差及消除 20.6 分光光度法的应用 20.7 荧光分光光度法 20.1 概述 20.1.1 分（吸）光光度法及其特点 比色法：利用有色溶液颜色的深度测定该溶液的浓度。 目视比色法：用肉眼直接比较样品和标准溶液的颜色深浅。 分光光度法：用光电比色计或分光光度计测量溶液吸光度。 分光光度法的特点： 灵敏度高。10-3 －10-6 mol/L。 准确度高。相对误差2－5％。 仪器设备简单、操作简便。 应用范围广。 20.1.2 吸收光谱 光谱区的划分 微波 远红外 近红外 可见光 近紫外 真空紫外 X-射线 ?-射线 波长 1000um 10um 100nm 10nm 红 620 － 750nm 橙 590 － 620nm 黄 570 － 590nm 绿 550 － 570nm 青 495 － 550nm 蓝 450 － 495nm 紫 380 － 450nm 190－400nm 2. 可见光吸收光谱 光的互补色示意图 白光 红 橙 黄 绿 青 青蓝 蓝 紫 单色光：单一波长光 复合光：复合波长光 互补光：处于同一直线上的两种光。 互补光按一定强度比例混合，即得白光。 溶液颜色：互补光的颜色。 吸光度：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶液后，被吸收的光的比例。 吸收光谱曲线：溶液对不同波长光的吸收强度，即以入射光波长为横坐标，吸光度为纵坐标所做的一条曲线。 最大吸收波长：物质对该波长的光吸收最大，即吸收光谱曲线上的最大峰值。 3. 吸收光谱曲线 透过率：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶液后，没有被吸收的光（即透过的光）的比例。 四种川芎内酯化合物的紫外吸收光谱图 1-洋川芎内酯H；2-洋川芎内酯I；3-瑟丹酸内酯；4-藁本内酯 物质分子的运动状态 分子轨道中价电子的高速旋转；原子在平衡位置的振动； 分子自身的转动。 分子的能量 价电子能级的能量＋振动能级的能量＋转动能级的能量 能级差与对应的光谱 价电子能级间能量差1-20eV，紫外-可见光的能量； 振动能级间能量差0.05-1eV，红外光的能量； 转动能级间能量差10-4-0.05eV，远红外光及微波的能量。 4. 物质吸收光的本质 吸收光谱与发射光谱 分子吸收能量后受到激发，分子就从基态能级跃迁到激发态能级，因而产生吸收光谱。 处于激发态的分子返回基态或能级较低的激发态，就会以光子的形式释放能量，从而产生发射光谱。 紫外-可见吸收光谱 分子中的价电子吸收特定波长的光（紫外-可见光）后，从基态跃迁到激发态。 20.2 光吸收定律 朗伯（Lambert）定律：一束单色光通过吸光物质的溶液后，光吸收程度（吸光度）与溶液液层厚度成正比。 A为吸光度; I0为入射光强 I为透过光强; T为透光度 k’为比例常数 b为液层厚度（光程长度） b I0 I 即： 比耳（Beer）定律： 一束单色光通过吸光物质的溶液后，光的吸收程度与吸光物质微粒（分子）的数目（浓度c）成正比。即： 朗伯-比耳定律： 当b单位为cm，c的单位为mol/L时的吸光系数称摩尔吸光系数?，其单位为cm-1?mol-1?L。 ?的大小与吸光物质的性质、入射波长和温度有关。 朗伯-比耳定律的适用范围： 不仅适用于溶液，也适用于均匀的气态吸光物质和固态吸光物质； 它是各种吸光光度法定量分析的依据。 思考：摩尔吸光系数如何测定？ 工作曲线（标准曲线）： 测定信号的大小随被测物浓度变化的曲线。要求这一曲线为直线，即测定信号与被测物浓度成正比。 理想情况下工作曲线过原点； 直线的线性范围是有限的（高浓度端偏离）；通常要求两个数量级以上的线性范围； 样品中被测物