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1份生产用中药蛇粗毒DNA分子鉴定 　【摘要】 　　目的利用PCR技术鉴定干燥蛇粗毒的来源物种，并对基因组DNA的提取效果及提取过程中需注意的若干问题进行分析和讨论，同时还对若干针对不同长度目的基因扩增引物的使用效果进行验证。方法从1份已保存了7年的生产用干燥蛇粗毒中提取总DNA，并以之为模板进行PCR扩增、测序和序列分析。结果使用该方法可从蛇粗毒中提取得到微量的总DNA，并成功扩增得到0.45～1.18 kb不同长度范围的目的片段；测序结果提交NCBI，并与GenBank中的同源序列进行BLAST比对。结论该蛇粗毒样品来自眼镜蛇，且极可能由多个不同的亚种或单倍型所组成。该技术有可能推广用于对动物粗毒的来源进行准确和直接地鉴定。 【关键词】 蛇粗毒；分子鉴定；线粒体基因； DNA测序 　　Abstract：ObjectiveTo identify dried snake venom by PCR. MethodsTo extract DNA and subsequent sequencing of the mitochondrial genes from a snake venom that had been preserved for nearly 7 years.ResultsMinimal genomic DNA could be extracted from the crude venom by this method, and from which different length of target regions that ranged within 0.45～1.18 kb were amplified successfully. All the sequences were submitted to NCBI and compared against their homologous sequences in the GenBank database. ConclusionSequence alignment analyses approved that Naja naja was its most probable original specie, and this sample could be consisted by some different subspecies or haplotypes. This approach offers a straight forward method for direct and accurate identification of animal crude venoms. 　　Key words：Snake crude venom； Molecular identification； Mitochondrial gene； DNA sequencing 　　近年来，有关中药中毒病例的报道为数不少，如中药性肾损害、中药致癌等问题已引起了国内外学者的高度关注。目前，已发现有包括蛇毒（其它如斑蝥、鱼胆、海马和蜈蚣等）在内的近十几种动物类中药均可致肾脏损害［1］。研究发现，导致此类损害的主要原因可分为中药内在属性不明确以及用药方式不恰当两方面。其中决定中药内在属性最基本的因素——即动、植物种属分类，则时常为研究者所忽略，由此带来的后果，如物种命名不规范等，均可导致药品质量不稳定以及毒副作用发生变化等诸多不良后果。以含蛇粗毒类成分的中药为例，研究者在制剂过程当中对药用原料的来源物种进行准确地鉴定是非常必要的，是决定用药安全的首要环节。 为解决以上实际问题，本文成功从1份已保存了7年的生产用干燥蛇粗毒中提取总DNA并对其来源物种的身份进行了初步地鉴定，同时对可能影响到鉴定效果的一些因素进行了探讨。 　　1 器材 　　1.1 材料 　　生产用蛇粗毒由中国人民解放军广州军区广州总医院药学部提供（批号：001212），样品采集于200005，由广州市蛇毒研究所经生化鉴定为舟山眼镜蛇（Naja naja atra）粗毒。新鲜毒液经冷冻干燥处理后铝罐密封，置4 ℃长期储存。 　　1.2 试剂与仪器 　　DP 303离心柱型基因组提取试剂盒和DNA Marker III（天根生化科技有限公司），2×Taq PCR MasterMix（广州美津生物技术有限公司），PCR产物胶回收纯化试剂盒（北京艾科基因技术有限公司），蛋白酶K（Amresco公司），引物（北京赛百盛基因技术有限公司合成），dNTPs，PCR缓冲液，rTaq DNA聚合酶和DL 15 000 DNA分子量标记（宝生物工程大连有限公司）。PE-2400型PCR扩增仪（美国Perkin Elmers公司），373