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2型糖尿病中医湿热困脾证基因表达探究 　 作者：柴可夫 黄晓玲 钱俊文 马纲 【摘要】 目的］从分子水平探讨2型糖尿病湿热困脾证的中医证候实质。［方法］抽取2型糖尿病气阴两虚证患者静脉血，检测血糖，血脂及电解质，分离血液中的白细胞，提取总RNA，化学发光方法检测基因芯片，用ScanAlyze软件采集图像，GEArray Analyzer软件分析数据。对部分差异表达基因进行RTPCR和Westernblotting方法验证。［结果］2型糖尿病湿热困脾证患者血糖，血脂，电解质与健康人有显著差异，基因芯片检测发现和健康人差异表达基因共38条，其中上调的基因有24条，下调的基因有14条。并发现湿热困脾证的特异性基因。通过RTPCR和Westernblotting方法反向验证IRS2和FOXC2基因，证实2型糖尿病湿热困脾证患者和健康人白细胞中存在IRS2和FOXC2存在差异表达。［结论］应用基因芯片筛选2型糖尿病湿热困脾证的差异表达基因，为2型糖尿病辨证论治提供新思路。 【关键词】 2型糖尿病;基因芯片;辨证分型 　　糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的慢性疾病。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱为主要共同标志。本研究观察糖尿病湿热困脾证的基因表达差异，探讨2型糖尿病湿热困脾证的证候实质。1 临床资料　　1.1 研究对象 对浙江中医药大学附属第二医院糖尿病防治中心400例糖尿病患者进行中医辨证分型，随机选取6例湿热困脾证患者，其中男性3例，女性3例，年龄30岁至65岁之间，年龄（57.6±7.7）岁。另选取年龄与性别相匹配的健康人6例作对照，平均为（50.8±9.4）岁。健康对照组皆通过血糖检查排除糖尿病，通过病史调查和体检、血象、肝肾功能、胸透、心电图等检查，排除其它内分泌疾病和各系统器质性疾病。 　　1.2 现代医学诊断标准 根据1999年WHO专家咨询报告诊断标准，空腹血糖（FPG）≥7.0mmol/L(126mg/dl)；或糖耐量试验（OGTT）中服糖后2小时血糖（2HPG）≥11.1mmol/L(200mg/dl)；或随机血糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)。 　　1.3 中医辨证标准 参照2002年版《中药新药临床研究指导原则（试行）》中“中药新药治疗糖尿病的临床研究指导原则”，湿热困脾证,主症：胸脘腹胀，或食后饱满，头身困重。次症：体形肥胖，心胸烦躁，四肢倦怠，小便黄赤，大便不爽。舌脉：舌红苔黄腻，脉滑而数。 　　1.4 病例纳入和排除原则 凡符合现代医学诊断标准和中医辨证标准，可纳入试验病例。排除①有糖尿病急性并发症；②经确诊为1型糖尿病，其它类型糖尿病及妊娠糖尿病者；③年龄在40岁以下或70岁以上，妊娠或哺乳期妇女；④有严重心、肝、肾等并发症，或合并有其它严重原发性疾病，精神病患者。⑤中医辨证症状不典型，或者两型三型并见证型复杂者。 　　2 实验方法 　　2.1 一般情况 测量身高，体重。计算体重指数（BMI):BMI=体重（kg）/身高（m2）。 　　2.2 生化检测 所有受试对象均于上午8时前空腹抽取肘静脉血10ml，用于测空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白（HbAlc）、胰岛素抵抗指数（ISI=ln［1/(FBS×FINS)］）、血钙、血钾等生化检测。 　　2.3 基因芯片检测 　　2.3.1 白细胞的提取与RNA的纯化 随机选取其中3名湿热困脾证糖尿病患者和3名健康人抽取静脉血5ml，用红细胞裂解液分离白细胞，采用Trizol一步法抽提总RNA，用分光光度计在260nm和280nm分别测定吸光度，A260/A280比值在1.8～2.1为较纯的RNA，可用于芯片检测。 　　2.3.2 芯片杂交 经检测合格后的总RNA可用于合成双链DNA进行纯化。然后进行化学发光检测的Ampo LabelingLPR标记，变性的c DNA探针全部加入0.75ml预热的GEAprehyb中，混匀，放在60°C待用。弃去杂交管中的GEAprehyb溶液，加入含探针的GEAhyb混合液至杂交管中，60°C下6rpm杂交。 　　2.3.3 化学发光检测 洗膜后加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶（AP），再洗膜4次，加入CDPStar化学发光底物至杂交管中，室温孵育2min。用滤纸去除多余的CDPStar溶液，用X射线胶片曝光。 　　2.3.4 图像采集和数据分析 运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，使用芯片配套软件GEArray Analyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。 　　2.4 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法验证部分差异表达基因。 　　2.4.1 引物设计 将RNA反转录合