3种5’RACE技术比较及优化.docVIP

3种5RACE技术比较及优化 　 【摘要】 　目的 研究 环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5’RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。 方法 以播娘蒿RNA为模板，先按 文献 标准方法进行5’RACE，然后通过增加反应时间，提高部分反应物浓度等方法进行优化。结果 未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见，SMART反转录酶法隐约可见条带，但不清晰。优化条件后，环化法出现弥散条带，TdT酶法胜之，但条带依旧弥散，而SMART反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。结论 SMART 5’RACE效果最好，其次为TdT酶法，环化法效果有待改进，同时通过优化条件可以明显增加产物的特异性，为实验研究中5’RACE方法的选择提供了依据。 中国论文联盟编辑。 【关键词】 5’RACE；比较；优化 论文代写 Abstract：Objective To study the characters of Cycling 5’RACE,TdT 5’RACE and SMART 5’RACE methods and optimize them.Methods Standard 5’RACE ways were done at first with RNA templet of Descurainia sophia. The n they were optimized with delaying the reaction time and increasing the concentrations of some reactants.Results Before optimized,the gel-straps in Cycling 5’RACE and TdT 5’RACE were invisible.The gel-strap in SMART 5’RACE could be found but not clear.After optimized,dispersed gel-straps appeared in Cycling 5’RACE,the result of TdT 5’RACE was better and still dispersed.The best was SMART 5’RACE, which got the clear and specific strap.Conclusion The result of SMART 5’RACE was best,TdT 5’RACE was better,and Cycling 5’RACE way was still under improving.With optimization,the specificity of the results could be obviously improved.It provided bases for choosing of 5’RACE methods in research. Key words:5’RACE;comparison;eptimization 经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病，即实验操作繁琐，周期较长、工作量繁重，且不易得到全长cDNA序列。近年来随着PCR技术的快速兴起和成熟，cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)为简洁方便的基因克隆 发展 道路指出了新的方向。RACE是利用PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA末端的方法，又称为锚定或单边PCR，一般有两种RACE方法，分别用于扩增3’端或5’端。5’RACE比3’RACE更具有挑战性，其特异性较低，产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。最终质量取决于扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA 5端结构的复杂度和丰度及产物的长度等因素。可利用巢式引物扩增（最多进行三轮巢式扩增），增加逆转录保温温度和PCR退火温度，降低扩增反应中的镁离子浓度等方法增加5’RACE的特异性。本试验通过利用5’RACE技术获得播娘蒿CBF基因的5’端序列，对常用的环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法［1］及SMART反转录酶法［2,3］3种5’RACE方法进行比较和优化。 1 试验材料 1.1 模板 毕业论文 播娘蒿在25℃下生长30 d后，将完整植株放置于4℃下冷驯化12 h后，取其叶片提取RNA。 毕业论文 1.2 引物设计与合成 毕业论文 根据已知播娘蒿CBF基因的EST序列，设计5’RACE反应所需引物。由于不同的原理，5’RACE有3种克隆扩增方法，因此根据不同