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3，4- 二氯异香豆素对胃癌细胞Smad1及PTEN基因影响 　 作者：刘飞，姜藻，顾晓怡，费正华，苏沐，任雪萍 【摘要】 目的：探讨蛋白酶体抑制剂3，4- 二氯异香豆素（DCI）对人胃癌细胞株BGC- 823细胞Smad1及PTEN基因的影响。方法：MTT法检测DCI、5-FU单药及联合干预后BGC- 823细胞的生存率，流式细胞术检测细胞凋亡率及周期分布状况，RT- PCR法检测Smad1和PTEN基因表达。结果：75 μmol·L–1 DCI干预24 h后，细胞生存率为（84.0±9.60）%，750 μmol·L–1DCI作用72 h后，细胞生存率仅有（20.3±9.7）%；同时，当DCI浓度从150 μmol·L–1上升至600 μmol·L–1时，细胞凋亡率相应地从15.0%增加至27.8%；DCI可以增强5-FU对胃癌细胞的杀伤作用；DCI浓度依赖性地上调Smad1和PTEN基因表达(Plt;0.05)，当DCI浓度从150 μmol·L–1上升至600 μmol·L–1时，Smad1和PTEN基因分别从上调19.45%、6.16%升至上调72.85%、48.46%。结论：蛋白酶体抑制剂DCI可能通过干预骨形态发生蛋白（BMP）信号通路减少Smad1降解、增加PTEN表达，产生抗肿瘤效应。 【关键词】 胃癌细胞； 3，4- 二氯异香豆素； Smad1； PTEN 泛素介导的蛋白酶体降解是调节骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）信号转导功能的重要机制，蛋白酶体抑制剂可剂量依赖性地逆转Smad泛素调节因子1（smad ubiquitin regulatory factor 1，Smurf1）对Smad1、5的降解作用［1- 4］。由于Smads是BMP信号通路中的关键调节因子,因此改变Smads蛋白水平可能影响BMP信号通路及靶基因如PTEN的状态。本实验探讨蛋白酶体抑制剂3,4-二氯异香豆素（3，4-dichloroisocoumarin,DCI）对胃癌细胞株BGC- 823细胞Smad1及PTEN基因的影响，以及DCI联合5-FU对BGC- 823细胞株增殖的影响。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 试剂及仪器 DCI（Santa cruz 公司），贮存于-4 ℃；5-FU（上海旭东海普药业有限公司产品）；MTT及DMSO（Sigma公司）；酶标仪（Model- 550，BIO- RAD公司）； Annexin- Ⅴ检测试剂盒及周期试剂盒（Becton Dickinson公司）；流式细胞仪FACS Calibur（美国BD公司）；逆转录试剂盒及PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司）；TaKaRa试剂盒；引物由Invitrogen公司合成；PCR扩增仪Eppendorf 5331（Eppendorf公司）；紫外分光光度仪JENWAY6405（英国JENWAY公司）；凝胶成像分析系统LMS- 26E（UVP公司）。 1.1.2 细胞及培养 胃腺癌细胞BGC- 823由作者所在实验室传代培养，在含10%胎牛血清的培养液中呈单层贴壁生长，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，用0.25%胰酶消化后制成细胞悬液备用。 1.2 方法 1.2.1 MTT法试验 取对数生长期的BGC- 823细胞，接种于96孔板，每孔细胞数为1.5×104个。培养24 h，加入含不同浓度DCI和（或）5-FU的新鲜培养液，每浓度设3个复孔，进行分组。单纯DCI组：加25、50、75、150、300、450、600、750 μmol·L-1的DCI；单纯5-FU组：加12.5、25、50、100、200 mg·L–1的5-FU； 5-FU加DCIa组：加12.5、25、50、100、200 mg·L–1的5-FU，同时每孔联用25 μmol·L–1 的DCI；5-FU加DCIb组：加12.5、25、50、100、200 mg·L–1的5-FU，同时每孔联用50 μmol·L–1的DCI；对照组：予不含DCI或5-FU的培养液。除单纯DCI组孵育24、48、72 h外，其余各组孵育24 h后用MTT法测每孔吸光度(A)值。 1.2.2 流式细胞术分析 取对数生长期BGC- 823细胞，以不同浓度DCI处理后，采用流式细胞术定量分析细胞凋亡状况及周期分布。 1.2.3 RT-PCR检测 取对数生长期BGC- 823细胞约1×106 ml–1，分别予150、300、450、600 μmol·L–1 DCI干预，37 ℃培养24 h后，用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA。紫外分光光度仪测纯度和浓度，取 3 μl RNA行RT反应，得各自的总cDNA。取cDNA 产物2 μl，分别以Sm