透明质酸生产工艺概论-姬跃莹.pptVIP

广西科技大学（筹） 透明质酸发酵工艺原理综述 姬跃莹 200900606030 生化系生物工程091 1. 发酵机制 1.1 生产菌种 1.2 生物合成途径 1.3 代谢调节机制 1.4 产物积累机制 1.1 生产菌种 兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus） 该菌在用于生产时有多种变异版本，如兽疫链球菌NW-162，兽疫链球菌ATCC39920等。 1.2 生物合成途径 链球菌属的多种细菌具有荚膜（如兽疫链球菌），这种荚膜的主要成分就是透明质酸。发酵法生产透明质酸就是利用兽疫链球菌在生长繁殖过程中，向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜，再处理发酵液（分离纯化）而得到高纯度的优质的透明质酸 。 还原端UDP2单糖残基已经改变的糖链进行移位, 运动到另外一个HA2单糖2UDP 供给部位;然后另一个UDP2底物结合部位和相应的UDP2单糖转移酶催化位点发挥活性,连入新UDP2单糖,糖链再变换HA2单糖2UDP 供给部位;依次循环,不断地将UDP2GlcNAc 和UDP2GlcUA 连入糖链的还原端,延长糖链。 1.3 代谢调节机制 HA 在细胞内的合成是一个复杂的过程,有多种酶的参与,包括己糖激酶、葡萄糖磷酸变位酶、尿苷二磷酸(UDP) 2葡萄糖焦磷酸化酶、UDP2葡萄糖脱氢酶、磷酸葡萄糖异构酶、氨基转移酶、乙酰基转移酶、变位酶和UDP2N2乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶等。其中透明质酸合酶(hyaluronic acid synthase , HAS)是HA 合成途径中的关键酶。 1.4 产物积累机制 发酵过程中溶解氧控制在30% 饱和度左右时, 代谢副产物积累量较少, 有 利细胞生长和代谢产物HA 的积累, 而且也最为经济; ?? 有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是生成透明质酸的两个活化前体物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物质。因此从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于透明质酸的合成。 2. 发酵过程控制 2.1 发酵工艺流程 2.2 发酵控制要点 2.1 发酵工艺流程 斜面种子→摇瓶种子→接种→发酵培养→补料→放罐→发酵液（加乙醇粗提）→粗提液（加助滤剂、活性炭，调pH）→过滤（去除杂质）→滤液（乙醇沉淀）→沉淀物（脱水干燥）→成品透明质酸 2.2 发酵控制要点 2.2.1 发酵过程中溶解氧(DO)的控制 发酵液中溶氧低于临界溶氧30%时, 无氧呼吸造成发酵液中乙酸、乙醇含量增高, pH值降低, 抑制细胞生长和产物表达; 当溶氧高于临界溶氧30% 时, 细胞的耗氧速度基本保持不变, 但增加生产成本。所以DO 控制在30% 饱和度时, 有利于细胞生长和HA 的积累。 2.2.2发酵过程中pH的控制 由于菌体在生长过程中产酸使pH 迅速下降, 改变菌体的生存环境, 使细胞生物量增长迅速下降。如果在适当的时间调整pH, 使其利于菌体的繁殖,那么就可能延长对数生长期, 提高HA产量。当培养基起始值为7. 2时, 菌体生长最好, 故最适pH 值为7. 2, 而积累最适pH 值为6. 8。所以在发酵条件基本不变情况下, 在发酵前期4~10 h pH 7. 2, 有利于菌体繁殖。 3.产物分离纯化 3.1 工艺流程 3.2工艺要点说明 3.1 工艺流程 总体上分离纯化工艺过程可以概括为如下流程： 发酵液一预处理一分离(初步纯化)一纯化一干燥一成品。 3.2工艺要点说明 3.2.1预处理 预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭 菌、除菌的工艺。对于一些非透明质酸酶缺陷型菌 株发酵所得的发酵液，通过预处理可以杀灭透明质 酸酶，减少HA分子量的降低。 3.2.2分离工艺 3.2.2.1 乙醇分离 除去发酵液中的菌体后，需要将HA分离出来， 这是一个初步纯化的过程。乙醇沉淀是分离各种多 糖常用的一种方法，可以使HA有效脱水、脱色， 从而提高HA产品品质。为了使HA完全沉淀，溶液中应有足够的离子强度，常加入浓度为l％左 右的NaCl或NaAc以达到适宜的离子强度。乙醇添 加量一般为发酵液体积的2倍。 3.2.3 纯化工艺 3.2.3.1 季铵盐纯化 氯化十六烷基吡啶(CPC)是一种季铵盐类阳 离子表面活性剂，它能与黏多糖分子中的聚阴离子形成络合物，此络合物在低浓度盐溶液中产生沉淀，而在高浓度的盐溶液中逐渐解离，引起HA与CPC复合物解离所需的盐浓度远比其它黏多糖与CPC复合物解离所需浓度要低，利用此性质可达到纯化HA的目的。 关于分离纯化存在的问题 从发酵液中分离纯化