Wee1GFP在CTL介导细胞毒效应中作用探究.docVIP

Wee1GFP在CTL介导细胞毒效应中作用探究 　【摘要】 　　目的: 研究Wee1GFP融合蛋白对胞毒T细胞介导的胞毒效应的影响。方法: 采用脂质体将融合基因Wee1GFP导入鼠胰岛瘤细胞(NIT1)并检测其表达。以转染pWee1GFP和空载体的NIT1为靶细胞, 采用ELISA凋亡试剂盒和乳酸脱氢酶法检测胞毒T细胞介导的细胞毒效应。结果: Western blot检出Wee1GFP融合蛋白的表达。转染Wee1GFP的靶细胞发生凋亡及损伤的细胞数比转染空载体的靶细胞少。结论: Wee1GFP基因转染靶细胞具有一定的抵抗CTL介导的胞毒效应的能力。 【关键词】 凋亡 Wee1 细胞毒效应 　　近年来, 胰岛细胞移植治疗糖尿病正日益受到人们关注。无论是1型糖尿病还是2型糖尿病都存在胰岛β细胞的衰竭问题。在糖尿病的自然病程中, 胰岛β细胞功能的持续恶化是一个不可逆的过程, 采用胰岛细胞移植治疗糖尿病可能成为恢复胰岛β细胞功能以根治糖尿病的一个重要手段。然而组织来源不足限制了胰岛细胞移植的广泛开展,因而再造分泌胰岛素的克隆细胞并进行移植以重建胰岛细胞功能, 为糖尿病治疗提供新的研究方向, 而胰岛细胞移植同样面临免疫排斥的问题。杀伤性T细胞的杀伤机制在器官移植排斥反应发挥重要作用[1], 本研究将Wee1GFP基因导入胰岛瘤细胞株NIT1细胞, 以研究该融合蛋白在胞毒T细胞介导细胞毒效应机制中的作用。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 MTT(Sigma公司); 乳酸脱氢酶（LDH）底物溶液（Roche公司）; ELISA凋亡检测试剂盒（Roche 公司）; 脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen); 核蛋白提取试剂盒（南京凯基生物）; 重组质粒pCMVWee1/GFP（华中科技大学同济医学院免疫学系惠赠）; 质粒pKENGFP(本室保种); NIT1细胞株（小鼠胰岛瘤细胞株, 澳大利亚WEH1实验室惠赠, 本室保存）; 8周龄BALB/c小鼠（暨南大学医学院实验动物中心）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因转染和筛选 将NIT1细胞接种于6孔培养板, 细胞数3×105/孔, 培养24 h, 80%细胞融合, 按LipofectamineTM2000试剂说明书方法将质粒pWee1GFP及空载体pKENGFP分别导入NIT, 转染后48 h加入G418(500 mg/L)进行筛选, 并在荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况。转染pWee1GFP的NIT记为NITwg, 转染pKENGFP的NIT记为NITg。 　　1.2.2 Western blot检测蛋白的表达 收集培养的NITwg细胞和NITg细胞, 弃去培养液, 细胞用预冷的PBS洗涤2遍, 按照KEYGEN NuclearCytosol Extraction试剂盒提取细胞核蛋白质。采用兔抗人Wee1多克隆抗体进行Western blot检测Wee1的表达。 　　1.2.3 效应细胞的制备 体外混合细胞培养制备效应性T细胞: 将NIT1细胞（1×109/L）用丝裂霉素C处理, 终浓度30 mg/L, 37℃ 1 h后与小鼠脾脏单个核细胞（MSMC）于24孔板中混合培养（2 mL RPMI1640培养液含1×107鼠MSMC, 1×106 NIT1细胞, IL250 U/mL, ConA 5 mg/L）, 6 d后收集淋巴细胞, 记为鼠TcA。体内外联合免疫小鼠制备效应性T细胞: 取BALB/c小鼠, 腹腔注射NIT1细胞2次, 第1次注射1×107（0.5 mL）细胞, 间隔2周同量再注射1次, 5 d后分离小鼠MSMC作为反应细胞。以丝裂霉素C处理的NIT1细胞为刺激细胞, 按上法进行混合细胞培养, 6 d后收集鼠淋巴细胞, 记为鼠TcB。 　　1.2.4 ELISA检测细胞凋亡 以上述鼠TcA和鼠TcB为效应细胞, 以NITwg和NITg细胞为靶细胞, 效靶比为12.5∶1, 按ELISA凋亡检测试剂盒方法检测效应细胞诱导的细胞凋亡。以下列公式计算细胞释放的单或低聚核小体特别聚集值: 聚集因子=实验孔的mU/对照孔的mU; mU=双孔平均A值－底物A值; 注: mU=吸收值(10-3)。 　　1.2.5 LDH法测定胞毒T细胞介导的细胞毒作用 以鼠TcA和鼠TcB为效应细胞, 以NITwg及NITg为靶细胞, 效靶比为12.5∶1分别加入96孔板, 同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组, 采用乳酸脱氢酶（LDH）法进行检测, 根据公式计算细胞杀伤率: 细胞杀伤率=[（实验组平均A值－自然释放对照组A值）/（最大释放对照