Snail／GST融合蛋白原核表达及其多克隆抗体制备.docVIP

Snail／GST融合蛋白原核表达及其多克隆抗体制备 　 作者：张儒英，云昆仑，乔惠珍，王冰晶，张志谦 【关键词】 Snail；融合蛋白；多克隆抗体 0 引言 上皮型钙粘附素（Ecadherin，Ecad）介导的粘附系统的破坏，是肿瘤从非浸润性转化为浸润性的关键步骤［1］。而锌指转录因子Snail，具有下调Ecad的作用［2］，本研究通过制备Snail抗体，为进一步开展Ecad的功能研究和应用奠定了基础。 1 材料和方法 1.1 主要试剂和菌株 主要试剂购自北京中山公司；大肠杆菌DH5a和BL21由北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所细胞实验室保存。 1.2 pGEX4T1 /Snail原核表达载体的克隆 从人血管内皮细胞提取总RNA，在逆转录酶作用下，合成cDNA。以逆转录的cDNA为模板，用上游引物5′CTGCAGGACTCTAATCCAG3′（含有EcoR I内切酶位点）和下游引物5′ATCCTTGGCCTCAGAGAGC3′（含有Sal I内切酶位点），进行PCR扩增，得到Snail C末端377bp的DNA片断；酶切、琼脂糖凝胶电泳分离后，用玻璃奶法（自制）纯化回收，与pGEX4T1原核表达载体定向连接。转化DH5α感受态细菌，提取质粒并酶切鉴定重组体。 1.3 融合蛋白的诱导表达与纯化 1.3.1 表达鉴定 表达质粒Snail/ pGEX4T1转化大肠杆菌DH5α后，经过酶切鉴定，挑取阳性细菌克隆至3ml LB/Amp+试管中培养3～5h。SDSPAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。 1.3.2 可溶性鉴定 离心诱导菌液，收集菌体，以PBS重悬（50μlPBS/1ml菌液），加细菌裂解液混匀，冰浴。加入Triton X100至终浓度为1%，冰浴。冰上以20Hz间歇超声裂解。再离心并分别收集上清和沉淀，进行SDSPAGE，证实融合蛋白以包涵体形式存在。 1.3.3 纯化 加5倍体积超声缓冲液悬浮沉淀，冰上间歇超声30s，离心弃上清。重复3～4次。沉淀加等体积SDSPAGE loading buffer，超声重悬，沸水煮5min后上样，100V电泳6～7h。用冷0.1MKCl浸泡胶，切下目的条带放入透析袋内。将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60V洗脱过夜，次日100V继续洗脱1h，然后反转电极向相反方向洗脱3～5min。吸出透析带内液体，蔗糖包埋浓缩，PBS透析。行SDSPAGE定量，即获得纯化的融合蛋白。 1.4 抗Snail多克隆抗体的制备 抗原为原核表达并经SDSPAGE胶纯化的GST/Snail融合蛋白，免疫新西兰白兔。取耳血，用ELISA法测定抗体效价，当效价达到10-5时，放血，收集血清。 1.5 抗体效价和特异性免疫学鉴定 1.5.1 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测抗体滴度：观察结果并用ELISA Reader测OD490nm。 1.5.2 Western Blot鉴定抗体 SDSPAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。 　 2 结果 2.1 Snail/ pGEX4T1原核表达载体的构建和鉴定结果 以Snail全长为模板，PCR大量扩增出Snail片段，经鉴定在约400bp处有条带扩出，与推算值相符；将目的片段装入 pGEX4T1原核表达载体后，酶切鉴定正确，在近400bp处有条带释放。 2.2 融合蛋白GST/Snail的诱导表达和纯化 经纯化的GST/Snail融合蛋白只有一条蛋白带。 2. 3 Snail多克隆抗体活性鉴定 2.3.1 ELISA鉴定 经制备型SDSPAGE进一步纯化的融合蛋白GST/Snail免疫新西兰兔获得抗血清，ELISA实验结果表明，其效价为5×105。 2.3.2 Western Blot 鉴定抗体 Snail/ pGEX4T1感染的细胞在近40KD处出现条带。 3 讨论 本课题通过基因工程手段原核表达Snail羧基端的GST融合蛋白［3］，然后免疫新西兰兔获得效价高、特异性强的抗Snail抗体，与一些进口抗体相比造价低，且适用于免疫荧光、石蜡切片等［4］，为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供了工具。我们利用该抗体研究了宫颈不同组织学阶段的蜡块标本，Snail1表达的免疫组织化学反应在宫颈癌中呈上升趋势，阳性表达率为81.9%，与正常及非典型增生组差别明显（P＜0.05），证明Snail与癌分化程度相关。表明了Snail是肿瘤进展过程中浸润的一个重要的调节因素［5］，为今后进一步揭示肿瘤的浸润和转移开创了新的途径和工具。 【参考文献】 ［1］ Cano A, PerezMoreno MA，et al. The transcription factor s