pEGFP-C1-U6质粒载体介导表达MDR1 shRNA质粒构建.docVIP

pEGFP-C1/U6质粒载体介导表达MDR1 shRNA质粒构建 　【摘要】 为了构建pEGFP-C1/U6载体介导MDR1短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)表达的质粒，针对MDR1的19碱基大小的片段，分别设计2对寡核苷酸，形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pEGFP-C1载体(命名为pEGFP-C1/U6)，两对DNA双链连接后形成中间由9个碱基序列间隔的反向互补序列，构建成能产生MDR1短发卡RNA的质粒。结果表明：经酶切、连接后构建成的质粒（pEGFP-C1/U6/A和pEGFP-C1/U6/B），经酶切与测序证实构建成功，无任何碱基突变。结论：成功构建了能表达MDR1 shRNA的质粒载体pEGFP-C1/U6/A和pEGFP-C1/U6/B，此项研究结果可能为临床上逆转肿瘤多药耐药提供一种有效的方法。　 【关键词】 pEGFP-C1/U6载体 　　Construction of pEGFP-C1/U6-Mediated Plasmid Expressing MDR1 shRNA 　　　Abstract To construct a plasmid expressing MDR1 short hairpin RNA (shRNA) mediated by pEGFP-C1/U6 vector， two coding sequences of 19 nucleotides were selected from MDR.Two pairs of oligonucleotides were designed for these two fragments.After annealing the formed double-stranded DNAs were ligated with plasmid pEGFP-C1/U6 (pEGFP-C1 vector with U6 promoter).The plasmids producing MDR1 shRNA were constructed from the inverted motif containing 9 spacers and four Ts. The results showed that the constructed plasmids were named pEGFP-C1/U6/A and pEGFP-C1/U6/B，and the constructs were identified by restriction and sequence analysis，no any base mutation was observed. It is concluded that plasmids of pEGFP-C1/U6/A and pEGFP-C1/U6/B expressing MDR1 shRNA were successfully constructed， providing a highly effective method for reversing the multidrug resistance in clinic. 　　Key words pEGFP-C1/U6 vector; MDR1 shRNA; 　plasmid 随着肿瘤治疗模式的改变，化疗在肿瘤病人综合治疗中的地位显得越来越重要，它在提高肿瘤病人近期和远期疗效中发挥着切实的作用。但在临床上，病人对化疗的反应可能是暂时或者不彻底的，肿瘤对药物内在或获得性耐药性，是最终导致肿瘤化疗失败的一个重要原因。产生耐药的肿瘤细胞对结构和功能上截然不同的药物表现出耐受性，即为多药耐药性(multidrug resistance，MDR)。 在MDR的多种机制中，研究最为深入的是Pgp/mdr1介导的MDR。P-gp属于ATP结合的盒式运输蛋白超家族成员，由定位于7号染色体长臂(7q21.1)的mdr1基因编码［1］，是分子量为170 kD的细胞膜蛋白。P-gp能够运输多种结构不同的底物，当药物进入浆膜后，P-gp与之结合，由此引起一个ATP结合区的活化，水解ATP，P-gp构象改变，将药物释放到细胞外［2，3］。MDR1的基因表达的下调，对于增强白血病化疗的敏感性具有很好的临床意义［4，5］。 RNA干扰（RNA interference，RNAi）是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法。它将与目的基因同源的含21-23个核苷酸的小分子干扰RNA片段（erfering RNA，siRNA）转染至靶细胞，与细胞内的内切酶形成诱导沉默复合体（RNA　induced silencing complex，RISC），RISC以siRNA为模板特异地识别其同源基因