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中药对日本血吸虫病肝纤维化形成影响 　【摘要】 探讨中药对日本血吸虫病肝纤维化形成的影响。方法：用免疫组化SABC技术结合计算机彩色病理图文分析系统，定量检测并分析中药治疗对日本血吸虫鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及转化生长因子β1（TGFβ1）的影响。结果：（1）感染组鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1均主要分布在虫卵肉芽肿内，呈密集片状着色。经中药治疗后Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1的着色均明显减少。（2）治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1的含量分别为0.2472Sv±0.1839、0.2358Sv±0.1736和0.1253Sv±0.0842(Sv为面密度)均显著低于感染对照组的0.4657Sv±0.01401、0.4510Sv±0.0987和0.2451Sv±0.1152(Plt;0.05)；（3）中药治疗组和感染对照组大鼠肝内，Ⅰ型胶原的含量均与TGFβ1的含量呈显著正相关（r=0.9534，Plt;0.05；r=0.8667，Plt;0.05），Ⅲ型胶原的含量亦均与TGFβ1的含量呈显著正相关（r=0.9626，Plt;0.05；r=0.9272，Plt;0.05）。结论：中药对日本血吸虫病肝纤维化的形成有抑制作用。 【关键词】 血吸虫病 肝纤维化 转化生长因子 晚期血吸虫病肝纤维化的防治因其形成机理复杂，涉及因素众多，迄今仍无有效的方法。但细胞因子对肝纤维化的影响已引起人们的关注，并进行了相关的研究[1～3]。有报道γ干扰素（IFNγ）对肝纤维化的形成有抑制作用。但IFNγ价格昂贵，且有一定副作用。因此我们充分发挥祖国医学优势，利用中药治疗血吸虫性肝病，观察其对肝纤维化形成的影响。 1 材料与方法 1.1 实验动物 30只健康雌性Wistar大鼠，清洁级，体重250g左右。购自中国科学院遗传与发育生物研究所动物中心。试验前，饲养大鼠各种用具均经2％过氧乙酸消毒。动物自由摄食本动物部生产的颗粒饲料，饮用普通自来水。 1.2 动物分组及模型建立 30只大鼠随机分为3组，即正常对照组、治疗组、感染对照组，每组10只。钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所，25℃下孵化尾蚴，治疗组和感染对照组每只经腹部皮肤接种日本血吸虫尾蚴100尾。 1.3 试剂 1.3.1 复方中药制剂由黄芪、蜈蚣、三七、鳖甲、当归、桃仁、连翘、夏枯草等中药组成，用先进水提工艺提取制备成含生药1g/mL浓度的水溶液，以备灌胃用。 1.3.2 吡喹酮购自北京紫竹药业有限公司（批号 1.3.3 第一抗体兔抗鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1多克隆抗体为武汉博士德公司分装的美国SantaGruz生物技术有限公司产品，效价均为1∶200。 1.3.4 免疫组化SABC试剂盒由正常血清封闭液、第二抗体（羊抗兔IgG）、SABC（链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物）液、抗原修复液、复合消化液组成。DAB显色试剂盒，由试剂A（3、3二氨基联苯胺浓缩液）、试剂B（H2O2浓缩液）、试剂C（TBS）浓缩缓冲液组成。以上两试剂盒均购自武汉博士德公司。 1.4 用药方法 1.4.1 吡喹酮感染尾蚴第七周，以100mg/kg剂量每天给予吡喹酮杀虫治疗，用药6d。 1.4.2 中药制剂于感染尾蚴第八周开始，治疗组给予中药制剂灌胃，2次/d，1mL/只。正常对照组及感染对照组用生理盐水灌胃，1mL/只，2次/d。 1.5 取材 于感染第12周最后一天断颈放血处死，立即取肝脏，切成大小约2.0cm×1.0cm的组织块，置低温冰箱中保存备用。 1.6 Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1的检测 肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1的检测均采用免疫组化SABC法。简述之：将冷冻保存的肝脏冰冻切片，吹干、纯丙酮固定30min，室温干燥。1.5%双氧水/甲醇液处理10min，以灭活内源性过氧化物酶。加正常山羊血清封闭液，室温10min。分别滴加按1∶200稀释的第一抗体（兔抗鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1），37℃，2h。PBS洗净后，滴加生物素化的羊抗兔1Gg，37℃，20min，PBS洗涤后加链酶亲和素生物素过氧化物酶复合液，37℃，20min，PBS洗5min×4次。加DAB显色试剂盒中试剂A、B、C各1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间（一般10min）。常规洗净，甘油明胶封片。 1.7 结果判定 1.7.1 显微镜下的结果判定对Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1先行显微镜下观察，了解阳性目标的分布和形态，并对上述3组的阳性结果进行镜下对比分析。 1.7.2 计算机读片定量分析对Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1进行计算机读片，使用计算机MPZAS500多媒体彩色病理图文分析系统进行定量分析。每张切片选择最大的虫卵肉芽肿进行读片，统计场总面积为262