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中药益气化纤汤抗大鼠肺纤维化实验探究 　 作者：蔡望喜， 尹杉杉， 常建方 【摘要】 　　[目的] 观察益气化纤汤对肺纤维化模型大鼠肺泡巨噬细胞(AM)和肺间质巨噬细胞(IM)中转化生长因子β1(TGFβ1)mRNA表达的影响。[方法]选用Wistar大鼠96只，随机分为假手术组、模型组、益气化纤汤组(剂量为4g·kg-1·d-1)、氢化可的松组(剂量为20mg·kg-1·d-1);采用博莱霉素A5(剂量为6mg/kg)气管注入法复制肺纤维化模型;分别于造模第7、28天分离培养AM、IM，采用分子原位杂交法(ISH)检测TGFβ1mRNA的表达。[结果]模型组AM、IM中TGFβ1mRNA表达阳性细胞百分率及积分光密度(D)值显著升高(均Plt;0.01);益气化纤汤可显著降低AM、IM中TGFβ1mRNA表达阳性细胞百分率及D值(均Plt;0.01),其作用与氢化可的松相仿。[结论]益气化纤汤治疗肺纤维化的作用可能与其能降低TGFβ1的表达，抑制纤维化的发展进程有关。 【关键词】 益气化纤汤/药理学 肺纤维化/中药疗法 转化生长因子β 肺泡巨噬细胞/病理学 肺间质巨噬细胞/病理学 疾病模型 动物 大鼠 　　肺纤维化进程中转化生长因子β1(TGFβ1)的作用极为关键 。TGFβ1是致纤维化关键性的细胞因子，它可以通过自分泌、旁分泌等不同的方式，调节细胞增殖、分化、移行，促进成纤维细胞对胶原蛋白、纤维连结蛋白、蛋白多糖等细胞外基质的合成和沉积，从而导致脏器纤维化的形成[1]。益气化纤汤为我院治疗特发性肺纤维化的验方。本实验依据病理进程，分别收集实验第 7 天肺泡巨噬细胞(AM)、第 28 天肺间质巨噬细胞(IM)标本，采用分子原位杂交法(ISH)观察不同时间点巨噬细胞中TGFβ1 mRNA的表达情况，探讨益气化纤汤治疗肺纤维化的作用机制，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 雄性SPF级Wistar 大鼠，体质量170～210g，由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号为SCXK(鄂)20050005。 　　1.2 主要试剂与仪器 益气化纤汤(0.4g/mL)由湖北省中医院药剂科提供，批号注射用氢化可的松琥珀酸钠由天津市生化制药厂生产，批号博莱霉素A5为天津太河制药有限公司产品，批号：050601;TGFβ1原位杂交试剂盒购自武汉Boster公司，批号：060405;寡核苷酸探针序列：5ACCTGCAAGACTATCCACATGGAGCTGGTG3，5TGTACAACAGCACCCGCGACCGGGTGGCCG3，5GTACCAGAAATACAGCAACAATTCCTGGCG3;Ficoll细胞分离液为美国GE公司产品，批号：289124;胶原酶Ⅰ为美国Invitrogen 公司产品，批号：124224l;DNA酶由中国华美生物技术有限公司提供，批号：2213123L。 　　1.3 动物造模[2]、分组及给药 大鼠用戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于操作台上,颈部正中线切口，钝性分离暴露气管，8号头皮针从气管软骨环间隙刺入气管，将博莱霉素A5 (6mg/kg)注入并使药物均匀分布在肺内，缝合肌肉、皮肤。假手术组除注入气管的为生理盐水(NS)外，其他同手术造模法。将96只大鼠随机分为4组，假手术组、模型组、益气化纤汤组和氢化可的松组，每组24只。假手术组及模型组均灌胃给予生理盐水10mL·kg-1·d-1;益气化纤汤组灌胃给药益气化纤汤4g·kg-1·d-1; 氢化可的松组皮下注射氢化可的松20mg·kg-1·d-1，依据病理进程，各组大鼠分别于第7、28天各处死9只。 　　1.4 肺泡巨噬细胞、肺间质巨噬细胞分离培养[3-4] 肺泡巨噬细胞分离收集：第7天处死动物，收集肺泡灌洗液3mL离心(4℃、2500r/min×10min )，弃上清，用NS洗涤细胞3次(4℃、2500r/min×10min) 。将沉淀与0.5mL NS混匀，取100μL做细胞涂片(玻片用多聚赖氨酸处理)，用1g/L焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的多聚甲醛固定30min，蒸馏水冲洗4 次，吹干，-20℃ 保存。 　　肺间质巨噬细胞分离培养：无菌新生牛血清(FCS)于56℃水浴30 min灭活补体，加入Ⅰ型胶原酶、DNA酶配成含体积分数10% FCS的RPMI1640消化液，其中Ⅰ 型胶原酶浓度为200U/mL，DNA酶浓度为0.02mg/L ，抽滤灭菌，4℃ 保存。第28天处死大鼠，常规消毒，在超净工作台内，取右肺于无菌培养皿中。用DHanks 液洗净，剪碎肺组织，玻璃匀浆器研磨，离心(4℃、2500r/min×15min)，弃上清，加入消