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人Era蛋白在大肠杆菌中高效表达及其纯化 　 作者：吴元明，陈苏民，陈南春，纪宗玲，刘惠萍，张俊杰 【关键词】 人Era基因 　　关键词: 人Era基因;基因表达;蛋白纯化 　　摘 要:目的 在大肠杆菌中对人的era基因（简称hera）进行表达、纯化. 方法 PCR扩增hera基因，测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-C，重组质粒pRSETC-hera以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌，用IPTG进行诱导表达.然后利用亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化. 结果 克隆了hera基因，测序正确;利用pRSET-C载体在大肠杆菌中融合表达了全长hera-cDNA基因，表达量占细菌总蛋白的59.6%.融合蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在，在变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白，其纯度达到了98.0%. 结论 利用基因重组技术在大肠杆菌中高表达了hera基因.并对融合蛋白进行了初步纯化. 　　　Keywords:human Era gene;gene expression;protein purifi-cation 　　Abstract:AIM To express human Era protein in E.coli and purify it preliminarily.METHODS After being amplified by PCR and identified by sequencing the human era gene was in-serted into expression vector pRSET-C.The recombinant plasmid pRSETC-hera was transformed into BL21（DE3）and　induced with IPTG.The expressed protein was purified by affinity chromotography.RESULTS The human era gene was amplified and the sequence proved to be correct.The hera-cDNA gene had been cloned into the vector and ex-pressed in E.coli，and the expressed protein took59.6%of the total bacterial protein.The fused protein existed in the pattern of inclusion body，and it was purified on denatured condition by using Ni-NTA affinity chromotography column.CONCLUSION The hera gene could be expressed with high efficiency in E.coli by using gene recombination technique.The fused protein is purified preliminarily. 　　0 引言 　　era基因是1986年在测定大肠杆菌基因组序列时，在编码RNaseIII的rnc基因下游发现的一个开放读框，因其编码的氨基酸序列与人及酵母的Ras蛋白有部分相似之处，命名为E.coli Ras-like（era）基因［1］ .era基因在原核生物中普遍存在，在真核生物如蠕虫、小鼠、人、植物中也存在与细菌era高度同源的基因.Era蛋白是小G蛋白家族的新成员.它由两个结构域组成:N端是一个典型的GTPase结构域;C端结构域为Era所特有，其中含有一个KH结构域［2］ .在大肠杆菌中era基因和rnc基因同属于rnc操纵元，rnc基因和era基因的表达共同受RNaseIII的负调控［3］ .era是大肠杆菌中可以正常表达的基因，但表达水平极低.遗传学实验证实era基因与细胞周期和细胞分裂有关，是细菌生存繁殖所必需的重要基因 ［4］ .高表达的细菌Era蛋白有GTP结合及GTPase活性［5］ .最近发现细菌Era蛋白可以特异地与16S-rRNA结合［6］ . 　　本室陈苏民教授通过计算机寻索，发现从线虫、小鼠到人都有与细菌era同源的EST序列，并且相继克隆了人及小鼠全长的era-cDNA基因.人era-cDNA基因全长约2.2kb，含长度为1038bp的开放读框，编码346氨基酸的蛋白质［7］ .人Era（hEra）与大肠杆菌Era（eEra）蛋白全序列比较，有31.0%相同、53.0%相似.同样，hEra也是由N端