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人ERβ AF1融合蛋白表达及其多克隆抗体制备 　 作者：袁斌, 仇玮祎△, 李杰之, 丁丽华, 韩聚强, 熊志红, 杨智洪, 叶棋浓 【摘要】 　　目的: 制备雌激素受体β多克隆抗体。方法: 从人乳腺cDNA文库中PCR扩增ERβ AF1结构域（1～144位氨基酸）, DNA 重组插入原核表达质粒pGEXKG, 转化大肠杆菌DH5α, 异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GSTERβ AF1融合蛋白。纯化后免疫BALB/c小鼠, 制备鼠多抗血清。通过Western blot和免疫组织化学实验鉴定血清特异性和效价。结果: 成功构建了pGEXKG/ERβ AF1原核表达载体, 转化DH5α后可高效表达融合蛋白GSTERβ AF1, 免疫产生的ERβ多抗可特异检测ERβ真核表达载体转染人293T细胞及乳腺癌细胞中ERβ的表达。结论: 制备的ER 抗体对ERβ有反应原性, 效价高, 特异性好, 为进一步研究ERβ的生物学功能奠定基础。 【关键词】 雌激素受体β 融合蛋白 多克隆抗体 　　1996年, Kuiper等[1]从人睾丸和大鼠前列腺组织中克隆出一种新型雌激素受体ERβ, 与ERα一样, ERβ属于核受体超家族成员, 是一类配体调节的转录因子[2]。人ERβ（hERβ）基因位于14q22-24[3], 由530个氨基酸组成, 相对分子质量(Mr)约为60000, 其一级结构由N端到C端, 可分为A/B区(转录调控区)、 C区(DNA结合区)、 D区(多变铰链区)、 E/F区(配体结合区)等6个功能区[4]。ERβ与ERα相比肽链较短, 但其氨基酸序列在DNA结合区和配体结合区与ERα有高度同源性, 分别达96%和60%, 在活性功能区AF1和AF2同源性很低[5]。在分子水平上, ERβ通过经典的ERE途径、 AP1和Sp1位点等[6], 与内源性配体（如雌激素）或其他配体（如抗雌激素和植物雌激素）发生反应, 进而调节一系列靶基因, 调控靶组织（器官）某些正常生理功能的发挥（如维持骨密度, 生殖器官的发育）和某些肿瘤（如乳腺癌、 卵巢癌、 子宫内膜癌）的发生、 发展过程。由于多种肿瘤中都有ERβ的表达, 且共表达水平降低, 因此ERβ极有可能成为一种新型肿瘤分子标记, 有助于临床肿瘤的早期诊断。由于ERβ在正常生理及病理过程中均起到重要作用, 因此对ERβ功能的深入研究具有十分重要的意义。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 克隆载体pGEXKG、 pcDNA3FLAGERβ重组质粒、 E.coli DH5α均为本实验室保存。抗FLAG的单克隆抗体(mAb)均购自Sigma公司; 辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗鼠IgG购自Vector公司; SP试剂盒购自北京中山公司; 限制性内切酶BamH I和Xho I购自NEB公司; 高保真pfu DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶及IPTG购自Promega公司; 质粒提取试剂盒(包括小量提取、 大量制备2种)购自Qiagen公司; DNA胶回收试剂盒及PCR产物回收试剂盒购自Promega公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 重组质粒的构建 以乳腺cDNA文库(Clontech)为模板, 以P1(5′CG GGA TCC ATG GAT ATA AAA AAC TCA CCA3′)和P2(5′CCG CTC GAG CTA CCT CTT TGA ACC TGG ACC3′)为引物, PCR扩增编码1～144位氨基酸的ER 片段。以BamH I和Xho I双酶切PCR产物, 将PCR产物插入到同样双酶切的pGEXKG载体中, 即得重组质粒pGSTERβ(1～144位氨基酸, aa)。上述克隆所用PCR扩增条件为: 94℃变性3 min后, 按以下参数进行30次循环: 94℃变性30 s, 58℃复性30 s, 72℃延伸1 min。最后72℃延伸7 min。PCR扩增所用酶为pfu DNA聚合酶。重组质粒经载体上的通用引物测序。 　　1.2.2 GST融合蛋白的诱导表达及纯化 将上述构建的表达GST的融合蛋白的重组质粒和表达GST的空载体pGEXKG转化到E.coli DH5α中。转化于37℃振荡过夜, 再按2%的接种量转接, 30℃培养6 h后, 加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L, 20℃继续诱导培养过夜。收集上述诱导菌, 用谷胱甘肽Sepharose 4B小颗粒纯化GST融合蛋白, 基本按Pharmacia公司提供的方法进行, 即按10∶1 (V/V)的比例加入细胞裂解液(50 mmol/L TrisHCl pH7.5、 150 mmol/L NaCl、 1 mm