人类基因XAPC7真核表达载体构建及其在SMMC7721细胞中表达.docVIP

人类基因XAPC7真核表达载体构建及其在SMMC7721细胞中表达 　 作者：黄湘, 潘华政, 王穗海, 赵玉梅, 李明 【摘要】 　　目的: 构建pcDNA3.1()/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC7721中的表达。方法: 采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列, 将之与pMD18T载体连接、 测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1()中。构建好的pcDNA3.1()/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后, 采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC7721, 经G418筛选, 得到阳性克隆细胞株, 再应用半定量RTPCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平。结果: pcDNA3.1()/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实, 目的基因XAPC7的序列完全正确, 真核表达载体构建成功; 经RTPCR检测, 重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组, 证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论: 成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株, 为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础。 【关键词】 真核表达质粒 SMMC 7721 XAPC7 构建 表达 　　XAPC7基因编码人类蛋白酶体α7亚基（proteasome subunit, alpha type 7）, 该蛋白是20S蛋白酶体核心复合体的一个α亚基。作为蛋白酶体的一个亚基, XAPC7编码产物参与了HBV、 HCV和HIV病毒的复制及多种蛋白质的降解, 并与HBx、 HIF1、 cAbl及Arg等多种肿瘤相关的重要蛋白质相互作用; 同时该蛋白还参与膜蛋白的转运及对蛋白酶体活性的调节等; 此外本基因定位于20q13.33染色体, 既往研究提示人类肿瘤普遍伴随20 q的扩增[1, 2], 但XAPC7在肿瘤方面的研究目前国内外鲜有报道。为了研究XAPC7编码蛋白在肿瘤发生发展中的作用, 我们构建了重组人XAPC7真核表达质粒, 并将其转染入人肝癌细胞系SMMC7721中, 以便进一步探讨其对肝癌细胞生长、 死亡以及浸润、 转移的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 大肠杆菌DH5α和人肝癌细胞系SMMC7721均由本实验室保存。原核重组表达质粒pET28b/XAPC7由上海复旦大学季朝能教授提供。质粒小量抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自优晶公司。限制性核酸内切酶BamH I、 Xho I、 T4 DNA连接酶、 DNA Mr标准(DL 2000)、 pMD18T载体均购自大连宝生物工程有限公司。阳离子脂质体Lipofectamine2000、 TRIzol试剂、 G418和pcDNA3.1()真核表达载体购自Invitrogen公司。新生牛血清(FBS)购自GibcoBRL公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物设计 为人XAPC7基因克隆及半定量鉴定之用, 根据GenBank的基因序列(NM_002792), 应用软件Primer Designer 5.0各设计一对克隆引物及半定量引物。克隆引物: 上游: 5′CTCGAGATGAGCTACGACCGC3′; 下游: 5′GGATCCTGATGCTTTCTTTTGTTTC3′, 在上、 下游引物中分别引入Xho I、 BamH I酶切位点, 扩增大小为747 bp的人XAPC7 cDNA全长序列; 半定量引物: 上游: 5′GCCATCACCGTCTTCTCG3′; 下游 5′GCCCATTGCTCTGCGTAT3′, 扩增片段长度为355 bp。内参照βactin的引物序列为: 上游: 5′TGTGACGTGGACATCCGCAAAG3′; 下游: 5′TGGAAGGTGGACAGCGAGGC3′, 扩增片段为206 bp。所有引物均由Invitrogen公司合成。 　　1.2.2 目的基因cDNA的获取 以pET28b/XAPC7原核重组表达质粒为模板进行PCR扩增, 反应体系, 质粒模板0.1 μL, 10×ExTaq PCR Buffer 5 μL, dNTP(2.5 mmol/L) 4 μL, 灭菌蒸馏水38.65 μL, TaKaRa ExTaq (5 U/μL) 0.25 μL, 上游引物(20 μmol/L) 1 μL, 下游引物(20 μmol/L) 1 μL; 反应条件: 94℃ 4 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 40 s扩增25个循环; 72℃延伸7 min。PCR产物电泳后, 切胶回收目