先天性小耳畸形患者骨形态发生蛋白5成熟肽基因突变探究.docVIP

先天性小耳畸形患者骨形态发生蛋白5成熟肽基因突变探究 　【摘要】目的:探讨骨形态发生蛋白5（BMP5）成熟肽基因突变与先天性小耳畸形发病的关系。 方法 :收集临床确诊的散发先天性小耳畸形患者35例，用Trizol提取外周血白细胞总RNA，利用反转录聚合酶链反应单链构象多态性 分析 (RTPCRSSCP）技术进行BMP5成熟肽基因的突变分析，对异常电泳条带的RTPCR产物进行核苷酸序列测定，明确突变位点和方式。结果:从35例先天性小耳畸形患者中检测到1种错义突变：第 213位点发生TTTT→ACAC突变，编码氨基酸改变为苯丙氨酸→组氨酸。 结论:检测到的BMP5成熟肽基因突变可能为致病突变，其与先天性小耳畸形发病的关系有待于进一步 研究 。 论文代写 【关键词】 先天性小耳畸形;骨形态发生蛋白5成熟肽基因;突变 毕业论文 本论文由中国收集整理，转载请注明出处 先天性小耳畸形（microtia）也称小耳畸形综合征，其临床主要表现为外耳形态改变，外耳的基本结构消失或部分消失，仅有残余耳软骨及部分耳垂，甚至没有上述结构，而且常伴有外耳道闭锁、中耳畸形和颌面部畸形等症状，小耳畸形以单侧较多见。先天性小耳畸形在我国是一种较常见的先天畸形，发病率约为1/7000 ，在头面部先天畸形中位居第二，仅次于先天性唇腭裂畸形。先天性小耳畸形家族性病例少见，多以散发病例出现[12]。Kingsley等[34]曾先后发现小鼠小耳畸形的出现与骨形态发生蛋白5（BMP5）成熟肽基因突变密切相关。本研究 应用 反转录聚合酶链反应单链构象多态性分析（RTPCRSSCP）、DNA测序实验方法检测BMP5成熟肽基因在先天性小耳畸形患者中的突变情况，以探讨BMP5成熟肽基因突变与先天性小耳畸形发病的关系。 　　1 对象与方法 　　1.1 研究对象收集2003~2005年度东南大学附属中大 医院 整形外科先天性小耳畸形患者43例，男性33例，女性10例，年龄6~22岁。其中双侧耳畸形2例，伴有颅面短小者5例。所有患者均来自于江苏、安徽两省，皆为汉族人，无家族病史。 论文代写 　　1.2 仪器及试剂Eppendorf基因扩增仪、冷冻高速离心机（German），DYY8C型高压双稳电泳仪、DYCP31C型琼脂糖水平电泳槽、DYCZ28A型夹芯式垂直槽（北京六一仪器厂），ImageMaster VDS图像分析系统(USA)。Trizol试剂（上海生工生物工程有限公司），RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0(大连宝生物工程有限公司)，丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、TEMED、甲酰胺（南京生兴生物工程有限公司）。 论文代写 　　1.3 研究方法 毕业论文 1.3.1 引物 依据GenBank中BMP5成熟肽基因序列（GI设计两对引物，由上海捷倍思基因技术有限公司合成。引物 a：上游为5′CAAGGCG AGTGAGGTACTTC3′，下游为5′TTCATATGGGCGTT AAGTGG3′，扩增片断长度为270bp。引物 b：上游为5′CTATGTGAGCTTCCGGGATC3′，下游为5′GTGG CAGCCACATGAGCGTAC3′，扩增片断长度为289bp。 1.3.2 模板制备 取先天性小耳患者外周血1ml，用Trizol氯仿异丙醇法提取有核细胞中总RNA，25μl DEPC水溶解，-70℃保存作为RTPCR反应模板。 1.3.3 RTPCR反应 反应体积50μl。引物a反应组成分为：总RNA 2μl，MgCl2 1mmol·L-1，10×RTBuffer 1μl，Rnase Free H2O 275μl，dNTP 02mmol·L-1，Rnase Inhabitor 10U，AMV 025U，oligo dT 125pmol，5×PCRBuffer 10μl，灭菌蒸馏水 2775μl，Ex Taq 125U；上下游引物各 02pmol·μl-1。反应程序为:30℃ 10min，45℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min，94℃预变性2min，然后按94℃ 30s、54℃ 30s和72℃ 1min共进行35个循环，最后72℃延伸5min。引物b反应组成分为：总RNA 2μl，MgCl2 15mmol·L-1，10×RTBuffer 1μl，Rnase Free H2O 275μl，dNTP 02mmol·L-1，Rnase Inhabitor 10U，AMV 025U，oligo dT 125pmol，5×PCRBuffer 10μl，灭菌蒸馏水 2675μl，Ex Taq 125U；