响应面分析法优选生精汤中淫羊藿苷提取工艺探究.docVIP

响应面分析法优选生精汤中淫羊藿苷提取工艺探究 　【摘要】 目的优选生精汤中淫羊藿苷提取的工艺条件。方法采用响应面分析法，以提取物淫羊藿苷含量为指标进行实验，考察料液比、乙醇浓度、提取时间等因素对提取工艺的影响。结果优选出醇提淫羊藿苷的最佳工艺为：加30倍量70％乙醇，回流提取1.75 h，提取两次。生精汤中淫羊藿苷的含量为1.36 μg/g。结论该方法简便易行，稳定性好，适于工业化生产中应用。 【关键词】 响应面分析法； 淫羊藿苷； 提取工艺； Box-Benhnken中心组合实验 生精汤由菟丝子、淫羊藿、熟地、补骨脂、女贞子等11味中药组成。经动物实验［1］证明生精汤能显著降低模型大鼠血清雄激素含量，增加血清雌、孕激素含量促排卵。经多年临床应用［2］证实的生精汤为中医药补肾活血法治疗女性多囊卵巢综合征的有效组方。淫羊藿为处方中的君药，淫羊藿苷类黄酮化合物为其主要有效成分，此外含有生物碱、木脂素、多糖和微量元素等。现代药理实验研究表明［3，4］，淫羊藿总黄酮具有性激素样作用，可以使雌性小鼠子宫增重、E2含量升高、雄性小鼠血清T含量升高。淫羊藿苷能延缓卵巢卵母细胞巢破裂，抑制原始卵泡的发育启动，减少卵泡的消耗，使处于静止期的原始卵泡数增多［5］。淫羊藿总黄酮为生精汤治疗女性多囊卵巢综合征的主要有效成分之一。响应面分析法［6］以回归方法作为函数估算的工具，将多因子试验中因子与试验结果的相互关系函数化，可研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系，并可进行优化。本文采用响应面分析法，以提取物淫羊藿苷含量为指标进行实验，考察药材的料液比、乙醇浓度、提取时间等因素对提取工艺的影响，优选淫羊藿苷的最佳提取工艺，以便提出更多的有效成分，提高治疗效果。 　　1 仪器与试药 　　1.1 仪器LC-10AD高效液相色谱仪（日本岛津公司），CLASS-VP色谱工作站，GL-CQ-250S超声波清洗机（上海杰理科技有限公司），AE-240电子天平(上海梅特勒一托利多仪器有限公司)。W一201B数显恒温水浴锅(上海申腾生物技术有限公司)，R-201旋转蒸发器 (上海申胜生物技术有限公司)。 　　1.2 材料与试剂生精汤中各药材（菟丝子、淫羊藿、熟地、补骨脂、女贞子、山药、鸡血藤、刘寄奴、王不留行、制香附、生麦芽）购自浙江中医药大学饮片厂，并经浙江中医药大学姚振生教授鉴定。 　　淫羊藿苷对照品购自中国药品生物制品检定所，批号：110737-200312，乙腈、甲醇(供高效液相色谱测定用)为色谱纯，超纯水，其余为分析纯。 　　2 方法与结果 　　2.1 淫羊藿苷的含量测定［7］ 　　2.1.1 色谱条件 　　色谱柱为phenomenex-Genmini-C18(4.6 mm×150 mm)；流动相为甲醇－水（52－48）；流速1.0 ml·min-1；检测波长270 nm；柱温30℃；检测灵敏度0.02AUFS；进样量20 μl。 　　2.1.2 对照品溶液的制备 　　精密称取淫羊藿苷对照品2 mg，置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含有0.24 mg淫羊藿苷的溶液，作为对照品溶液。 　　2.1.3 供试品溶液的制备　 　　按处方取生精汤各味药材，精密称定，回流提取两次，合并提取液，混匀，浓缩至100 ml，取1 ml用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。 　　2.1.4 标准曲线的制备 　　精密吸取对照品溶液，倍半稀释后，分别注入液相色谱仪，记录淫羊藿苷峰的峰面积。以进样浓度C(μg/g)为横坐标，峰面积A为纵坐标进行线性回归，回归方程为：A=2×106C+109 929，r=0.999 9。表明淫羊藿苷在4.8～0.15 μg范围内，线性关系良好。 　　2.1.5 精密度实验 　　精密吸取浓度为0.2 μg/μl的对照品溶液，重复进样5次，每次20 μl，测定峰面积，计算RSD=0.28%，表明仪器精密度良好。 　　2.1.6 加样回收实验取已知含量的生精胶囊样品0.25 g，共5份，分别加入0.2 μg/μl的淫羊藿苷对照品10 μl，其余同“2.1.3”供试品溶液的制备方法制备，按“2.1.1”色谱条件进样20 μl，测定峰面积，并计算回收率，结果平均回收率为100.4%，RSD=2.5%，表明本方法具有较好的加样回收率。 　　　2.2 淫羊藿苷提取工艺研究 　　2.2.1 响应面分析法 　　因素的选取及方案分析按照处方分别称取生精汤各药材，共20.4 g，根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理［6］，综合单因素试验的结果，选取料液比、提取时间、乙醇浓度3个因素，每个自变量的低、中、高水平分别以-1，0，1编码，以淫羊藿苷得率作为响应值（Y）。采用SAS9.1.3对实验结果进行回归分析。试验