复方银黄微型灌肠剂对巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子及白细胞介素-6.docVIP

复方银黄微型灌肠剂对巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子及白细胞介素-6 　 作者：杨斌 蔡文娥 刘华钢 阳洁 【摘要】 目的研究复方银黄微型灌肠剂（Yinhuang Micro-enema Compound，YHMEC）含药血清对大鼠腹腔巨噬细胞（PMФ）分泌肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的影响。方法将大鼠随机分成3组，分别于末次灌肠给药后10，30，60 min采集含药血清，采用MTT比色法检测不同采血时间的含药血清对PMФ活力的影响；细胞培养上清液中TNF-α，IL-6的表达采用ELISA法检测。结果末次给药后30，60 min采集的含药血清对PMФ的活力及细胞因子的表达影响显著（Plt;0.05或Plt;0.01）。结论复方银黄微型灌肠剂含药血清能显著抑制LPS诱导的TNF-α，IL-6表达，具有明显的体外抗炎活性。 【关键词】 复方银黄微型灌肠剂 血清药理学； 巨噬细胞 肿瘤坏死因子 白细胞介素6 肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-6（IL-6）是重要的炎症介质，参与许多炎症反应［1］，脂多糖（LPS）可诱导大鼠腹腔巨噬细胞（PMФ）分泌TNF-α，IL-6明显增强［2，3］。复方银黄微型灌肠剂（Yinhuang Micro-enema，YHMEC）是由金银花、黄芩、柴胡等中药精制而成的纯中药制剂，具有清热、解毒、消炎等功效［4］。本实验主要通过研究YHMEC含药血清对PMФ的活力的影响及对由LPS诱导PMФ分泌TNF-α、IL-6的影响，探索中药微型灌肠剂血清药理学的实验方法。 1 器材与方法 1.1 材料与仪器YHMEC，由广西中医药研究所提供；脂多糖（LPS），购自美国Sigma公司产品；二甲基噻唑二苯基四唑溴蓝（MTT），美国Sigma公司产品；胎牛血清（FCS），杭州四季清公司；RPMI1640细胞培养基，美国Gibco公司产品；大鼠TNFα、IL6 ELISA试剂盒，晶美生物工程有限公司产品；联免疫检测仪(BioBad，model450)。 1.2 YHMEC含药血清的制备健康SD大鼠32只，体重220～250 g，♀♂各半。将大鼠随机分成4组，分别为A，B，C，D组，每组8只，其中B，C，D组灌肠给药YHMEC 8 ml/kg，A组给予相同剂量的生理盐水，2次/d，连续给药3 d。A，B，C，D组分别于末次给药后30，10，30，60 min行腹主动脉采血。待血液充分凝固后，2500 r·min-1离心分离血清，血清呈透明、淡黄色，未溶血。将同组血清充分混匀后0.22 μm过滤除菌，于-20℃保存，1个月内使用。 1.3 PMФ的分离、提纯和培养参考文献［5］并稍作修改，乙醚麻醉健康SD大鼠，体重250～300 g，♀♂不拘，颈椎脱臼处死。将预冷至4℃的RPMI1640培养液注入腹腔，无菌条件下抽取腹腔液，800 r·min-1离心5 min，于5%CO2培养箱培养1 h后用Hanks液洗去未贴壁细胞3次，再培养1 h后换液，2.5 g·L-1胰酶消化，含10% FCS的RPMI1640培养液重悬细胞，调细胞密度为2×106·ml-1，台盼蓝染色证明细胞活力gt;99%，于5%CO2培养箱继续培养。 1.4 检测指标及方法 1.4.1 YHMEC含药血清对PMФ活力的影响各实验组分为①正常对照组：10%FCS常规培养；② LPS组：予0.1 mg·L -1LPS刺激；③YHMEC含药血清+LPS组：分为16个亚组，即予0.1 mg·L -1LPS刺激，5%，10%，20%，40%的A，B，C，D组YHMEC含药血清培养。每组设5个复孔，孵育72 h后用酶标分析仪测定570 nm处各组光密度（OD）值，间接反应活细胞数量。 1.4.2 PMФ分泌TNF-α，IL-6的浓度测定各实验组分为①正常对照组：10%大鼠空白组（A组）血清培养；②LPS组：予0.1 mg·L-1LPS刺激，10%大鼠空白血清培养；③LPS+B组，予10 mg·L-1 LPS刺激，10%B组血清培养；④LPS+C组：予0.1 mg·L-1LPS刺激，10%C组血清培养；⑤LPS+D组：予0.1 mg·L-1LPS刺激，10%D组血清培养。于刺激3，12 h后留取细胞培养上清分别用于检测TNF-α，IL-6的蛋白表达，各组每个时间点取5个复孔。ELISA法检测TNF-α，IL-6含量按ELISA试剂盒操作说明书进行。 1.5 统计学处理计量资料均以±s表示，用SPSS12.0统计软件进行方差分析。 2 结果 2.1 YHMEC含药血清对PMФ活力的影响 2.1.1 不同浓度的空白血清影响PMФ活力的比较PMФ经LPS诱导，由静止性细胞成为有吞噬活力的炎性巨噬细胞。 为了解大鼠空白血清本身对PM