耐有机溶剂果糖苷酶的胞外表达纯化和结晶.PDFVIP

微生物学通报 Nov. 20, 2015, 42(11): 2126−2132 Microbiology China © 2015 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150035 研究报告 耐有机溶剂果糖苷酶的胞外表达、纯化和结晶 1 2 1* 苏汇 陈琼珍 何冰芳 (1. 南京工业大学 药学院 江苏 南京 218000) (2. 南京农业大学 生命科学学院 江苏 南京 218000) 摘 要：【目的】克隆表达一种Arthrobacter arilaitensis NJEM01 来源的耐有机溶剂β-呋喃果糖苷 酶(β-FFase) ，纯化并进行结晶条件的研究。【方法】构建pelB 信号肽与 β-FFase 融合表达质粒 pET22b-pelB -bff ，将其导入Escherichia coli BL21(DE3) 中诱导表达，硫酸铵沉淀、DEAE 阴离子 交换色谱两步纯化重组蛋白，采用坐滴式气相扩散法对 β-FFase 进行结晶条件筛选和优化。【结 果】构建重组质粒pET22b-pelB -bff ，通过优化诱导表达条件，IPTG 浓度0.1 mmol/L ，诱导温度 30 °C ，诱导时间10 h，比活力高达108 U/mg，实现了果糖苷酶的胞外可溶性表达，纯化获得达 到结晶纯度的β-FFase。结晶条件初筛和优化后获得可培养β-FFase 晶体的条件为0.15 mol/L 氯 化钙，0.1 mol/L HEPES pH 6.7 ，26%聚乙二醇400 。晶体衍射分辨率可以达到2.1 Å 。【结论】高 糖苷合成能力β-FFase 表达纯化体系的构建和结晶条件的初步研究，为从结构生物学角度进一步 研究果糖苷酶结构与功能的关系，定向进化提高糖苷酶转糖基活性奠定了基础。 关键词：果糖苷酶，pelB 信号肽，胞外表达，蛋白纯化，结晶 Expression, purification, and crystallization of an organic solvent-tolerant β-fructofuranosidase SU Hui1 CHEN Qiong-Zhen2 HE Bing-Fang1* (1. College of Pharmaceutical Sciences, Nanjing University of Technology, Nanjing, Jiangsu 218000, China) (2. College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 218000, China) Abstract: [Objective] This study aims to clone, express and purify an organic solvent-tolerant β-fructofuranosidase (β-FFase). [Methods] The recombination plasmid pET22b-pelB-bff by fusing the signal peptide gene pelB with bff wa