小剂量环孢素A治疗溃疡性结肠炎对肠黏膜中NFAT活性及GMCSF表达.docVIP

小剂量环孢素A治疗溃疡性结肠炎对肠黏膜中NFAT活性及GMCSF表达 　 作者：杨玉捷 惠玲 郭艳芳 张红霞 杨伟捷 葛勤利 张方信 毕业论文 【摘要】 　　目的： 研究 小剂量环孢素A(CsA) 治疗 的溃疡性结肠炎(UC)患者肠黏膜中核转录因子(NFAT)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的变化，及其对黏膜炎症的 影响 . 方法 : UC患者14例经CsA治疗，采用凝胶电泳迁移率改变 分析 法（EMSA）检测肠黏膜NFAT治疗前后活性的变化，半定量RTPCR法检测肠黏膜中GMCSF mRNA的改变，治疗前后对肠黏膜炎症程度进行评估. 结果: UC患者治疗后肠黏膜NFAT活性下降(0.80±0.31 vs 0.50±0.20, Plt;0.05), GMCSF mRNA表达也有降低（1.09±0.07 vs 0.49±0.03, Plt;0.01）, 肠黏膜炎症程度也下降（Plt;0.05）. 结论: 小剂量CsA治疗UC有效,其机制与调控NFAT的转录活性有关，并进一步降低激活因子GMCSF的表达. 【关键词】 结肠炎 溃疡性 环孢素A 核转录因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 毕业论文 0引言 溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）为一种肠道非特异性炎症，它的传统治疗包括激素、5氨基柳酸、硫唑嘌呤(AZA)或6巯嘌呤(6MP)等，超过60%的重度UC患者活动期需糖皮质激素治疗，但其中仍有15%～25%者激素治疗无效，属于激素抵抗或难治类型. 环孢素A（cyclosporine A, CsA）作为一种有效的免疫抑制药物治疗UC的临床研究显示，小剂量CsA的疗效与大剂量相似［1-3］，CsA主要是通过造成NFAT的激活和转移失败,影响IL2, IL3, GMCSF, TGFα等多种基因的转录,妨碍Ｔ细胞活化扩增及其免疫应答的产生,从而发挥免疫抑制作用［4］. 我们检测了使用小剂量CsA治疗UC后NFAT转录活性改变和对GMCSF表达的影响，并观察了肠黏膜炎症程度的改变. 1对象和方法 1．1对象住院UC患者14(男12，女2)例，均经纤维结肠镜和病 理学 检查确诊. 年龄18～67（43±11.5）岁. 全结肠型8例，左半结肠型4例，直肠炎型2例. 诊断符合现行标准（1993年太原全国慢性非感染性肠道疾病学术研讨会制定），均急性期. UC患者由同一位有经验的病理科医师阅读病理切片，评价其病理表现. 病理组织学分级标准参照 文献 ［5］. 所有患者接受过0.5～1 a的柳氮磺胺吡啶（SASP）治疗及1～2 wk的糖皮质激素联合治疗，效果均不佳. 随后开始每日静脉滴注CsA 2～4 mg/kg,用药7 d，病情缓解者改每日口服CsA 5 mg/kg，分2次口服. 每位患者CsA治疗前后各取50 mg活检组织，并立即贮存在液氮中备用. 1.2方法 1.2.1NFAT测定肠黏膜核蛋白提取参照Cui等［6］方法. 溶液A (mmol/L): HEPES 10 （pH 7.9）， KCl 10， DTT 1.0， EDTA 0.1， EGTA 0.1; 溶液B (mmol/L): HEPES 20 （pH 7.9）， KCl 0.4， DTT 1.0， EDTA 0.1， EGTA 0.1; 溶液C： PMSF 10 μmol/L， 肽胺5 mg/L， 抑酶醛肽5 mg/L， 抑肽酶5 mg/L. 冷冻组织50 mg放入匀浆器中研磨后，加入溶液Ａ 400 μL置冰上15 min，加入100 g/L NP40 25 μL，置震荡器上强烈震荡30 s，1200 r/min低温离心20 min，弃上清，用溶液B 100 μL重悬沉淀，4℃震荡45 min，1200 r/min低温离心5 min，收集上清即为核蛋白提取物，-70℃保存. G250法测定蛋白质含量，波长595 nm.寡核苷酸探针（序列为5′AGCTGAAAGGAGGAAAGCAAGAGTCATA3′，其中含有人类GMCSF启动子序列［7］，北京亚辉生物医学工程公司），标记［γ32P］ dATP（北京亚辉生物医学工程公司）， 按试剂盒说明方法进行. 置-20℃保存. 所有样本核蛋白定量为5 μg，在总反应体系20 μL中根据蛋白浓度调整蛋白体积，使蛋白与三蒸水的总体积为10 μL ，再加入Tris.Cl 0.2 mol/L, NaCl 1 mol/L, EDTA 10 mmol/L, MgCl 20 mmol/L, DTT 10 mmol/L, poly dI/dC 2 g/L（Sigma公司）各1 μL，250 mL/L甘油3 μL ，置冰上20 mi