小议人参皂苷Rg1对成年大鼠脑缺血后海马区神经干细胞影响.docVIP

小议人参皂苷Rg1对成年大鼠脑缺血后海马区神经干细胞影响 　　1、引言 　　研究发现，成年哺乳动物脑缺血后，神经干细胞(NSCs)在某些特定区域如侧脑室下区(SVZ)和海马齿状回颗粒下层(SGZ)的增殖能力有一定程度的提高，并且能分化为一定数量的神经元，但增殖分化的细胞远不能替代脑缺血后造成的大量神经元脱失，因此脑缺血成为人类致死、致残的主要疾病之一。人参皂苷Rg1 是人参的主要活性成分之一，对神经保护、增强记忆和抗衰老作用的研究已取得了一定进展。但对脑缺血后神经发生的影响研究较少。 　　本研究利用成年大鼠脑缺血模型，观察人参皂苷Rg1 对缺血后大鼠脑内海马区NSCs 增殖与分化的影响，探讨其对神经促进发生的作用，为临床应用人参皂苷防治缺血性脑血管疾病提供理论依据。相关阅读：临床医学检验论文 　　2、材料与方法 　　2.1 动物分组及模型制作 　　健康成年Wistar 大鼠60 只，雌雄不拘，由协和医科大学遗传所提供，合格证号： 　　SCXK(京)2002-0006。分设假手术组、单纯缺血(缺血)组和人参皂苷Rg1 治疗(治疗)组。每组20 只。根据Longa 线栓法制作大鼠右侧局灶性脑缺血模型。术中常规检测肛温，保持在(37.0 plusmn; 0.5)℃。大鼠术毕清醒后，观察其行为变化，按Longa 评分标准将大鼠的行为变化分为5 级。将1、2、3 级定为模型成功大鼠，0、4 级弃去。假手术组：只插线10 mm，不行其他条件干预。将各组大鼠又分为缺血后1、3、7、14 天4 个时间点。每个时间点5 只大鼠。 　　治疗组术前5 天腹腔注射人参皂苷Rg1(20mg/kg)，2 次/d。假手术组注射相同剂量的生理盐水。 　　2.2 主要试剂 　　人参皂苷Rg1 由内蒙古康源药业有限公司提供(批号：ZZ-5802-内卫药准字(1999)1787号，规格：350mg/10ml);一抗为鼠BrdU 单克隆抗体及抗兔Tuj-1、Vimentin 多克隆抗体;SABC 试剂盒、FITC 羊抗兔IgG 及TRITC 兔抗羊IgG 购自武汉博士德生物工程有限公司。 　　2.3 BrdU 标记的增殖细胞 　　用胸腺嘧啶脱氧核苷类似物BrdU 标记处于增殖状态的NSCs。采用脉冲标记，各实验组大鼠从处死前24 h 开始，腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，每3h 1 次，共4 次，末次注射后10h 处死大鼠。 　　2.4 免疫组织化学及免疫荧光染色 　　大鼠在麻醉后开胸，经升主动脉插管，先用生理盐水150 ml 快速冲洗，继而灌注4%多聚甲醛250 ml，灌注完毕后取脑，在4℃下将脑移入4%多聚甲醛固定6 h，然后移入30%蔗糖液中直到沉底。行冠状切面冷冻切片，片厚15mu;m。 　　2.4.1 单标免疫组织化学BrdU 检测 　　首先需要进行DNA 变性。切片入50%甲酰胺/2times;SSC，65℃温箱2 h，2 mol/L HCl 37℃30min，使DNA 变性。经0.01 mol/L 的TBS 漂洗后加入鼠单克隆抗BrdU 抗体，4℃过夜。采用SABC 法染色，切片置入葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺溶液显色，光镜下胞核呈紫蓝色为阳性结果。 　　2.4.2 双标免疫荧光染色 　　切片经冷丙酮固定20~30 min，50%甲酰胺/2times;SSC，65℃温箱2 h，2mol/L HCl 37℃30min，1%BSA(含0.3%Tri-tonX-100 的0.01 mol/L TBS 配制)，37℃30 min，行双标免疫荧光标记，切片分别加兔抗Tuj-1、Vimentin 抗体4℃孵育过夜，FITC 标记IgG(1∶100)37℃孵育30 min 后，再加一抗鼠单克隆抗BrdU 抗体(1∶200)4℃孵育过夜，然后加TRITC 标记IgG(1∶100)37℃孵育30 min，甘油缓冲液封固。用Radi-ance 2100TM 型激光共聚焦扫描显微镜观察。 　　2.5 图像分析 　　免疫组织化学BrdU 的阳性表达分别为各自染色条件下结构完整、定位明确、着色较深的细胞及细胞核。切片在(times;200)镜下，随机选取10 个视野，采用C8 真彩图象分析系统(北京航空航天大学生产)对BrdU 平均阳性细胞数进行测量分析计数。荧光双标在每张切片梗死侧截取10 个(times;400)视野，计数平均双标阳性细胞(BrdU+/Tuj-1+或BrdU+/Vimentin+)数。 　　2.6 统计学方法 　　采用SPSS 12.0 软件分析。数据计算用( plusmn;s)表示，两两比较用t 检验，Plt;0.05 为差异有显著性意义。 　　3、结果 　　3.1 BrdU 在脑组织的表达 　　BrdU 阳性细胞着色部位为胞核，成卵圆或椭