抗乙酰胆碱受体单链抗体及人血清白蛋白融合基因真核表达载体构.docVIP

抗乙酰胆碱受体单链抗体及人血清白蛋白融合基因真核表达载体构 　 作者：魏晶，李强，范华英，李芳芳，李红花，李英信，孟繁平 【摘要】 目的］构建真核表达体系，提高抗人乙酰胆碱受体单链抗体（ScFv637）与人血清白蛋白（HSA）融合基因（ScFv637HSA）的蛋白表达质量.［方法］扩增ScFv637HSA融合基因，经酶切处理后，克隆至真核载体pPIC9K，线性化处理后，电穿孔入毕赤酵母GS115.［结果］经电泳观察可见相对分子质量为2.6kbp的融合蛋白ScFv637HSA基因和真核表达载体pPIC9K基因片段.［结论］ScFv637HSA基因已准确地整合到毕赤酵母染色体基因组中. 【关键词】 重症肌无力；抗体；融合基因；真核表达 Construction of eukaryotic expression vector of a fusion gene of single chain variable fragment directed against acetylcholine receptor with human serum albumin ABSTRACT:OBJECTIVETo increase the protein expression level of fusion gene of single chain variable fragment (ScFv637) and human serum albumin (HSA) by using eukaryotic expression system.METHODSThe fusion gene (ScFv637HSA) was amplified and cloned into pPIC9K to construct recombinant vector pPIC9KScFv637HSA. The recombinant vector was linerized and transformed into Pichia Pastoris GS115 by electroporation.RESULTSThe sizes of the fusion gene and the pPIC9K were found to be approximately 2.6kbp and respectively.CONCLUSIONThe eukaryotic expression vector, which bears the fusion gene of ScFv637HSA, has been successfully constructed. Key words:myasthenia gravis;single chain variable fragment;fusion gene;eukaryotic expression 重症肌无力是抗乙酰胆碱受体抗体介导的依赖细胞免疫及补体参与的器官特异性自身免疫病,抗乙酰胆碱受体抗体的抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）分别与神经肌肉接头处突触后膜乙酰胆碱受体上2个相邻的α亚单位结合后，通过加速乙酰胆碱受体发生抗原调变及激活补体，使乙酰胆碱受体数量减少，出现肌无力和麻痹症状［1］.由抗乙酰胆碱受体α亚单位主要免疫原区抗体制备的抗原结合片段或单链抗体（single chain variable fragment, ScFv）与乙酰胆碱受体的主要免疫原区结合后，可特异性地封闭致病性抗体与乙酰胆碱受体的结合位点，从而对乙酰胆碱受体起到保护作用[2].本实验室曾制备了人源性抗乙酰胆碱受体主要免疫原区的单链抗体ScFv637[3]，为了克服ScFv637半衰期短的缺点，又将其与人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）相连，构建了ScFv637HSA融合基因[4].为提高融合蛋白的表达质量，选择了真核表达系统. 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种与质粒 大肠杆菌DH5α由荷兰马斯特里赫特大学医学院神经系神经免疫学实验室提供，质粒pPIC9K及毕赤酵母菌GS115由军事医学科学院输血研究所章金刚教授惠赠. 1.1.2 试剂 限制性核酸内切酶SnaB Ⅰ，EcoR Ⅰ和T4DNA连接酶为美国NEB公司产品；SalⅠ为大连TAKARA公司产品；High Fidelity PCR System5Kb，氨苄青霉素及其他化学试剂均为华美生物工程公司产品；Wizard Plus Minipreps/Midipreps DNA Purification System为美国Promega公司产品；TAKARA DNA ATailing Kit，T