比格犬注射重组腺病毒AdHGF后血清中抗腺病毒抗体及中及抗体.docVIP

比格犬注射重组腺病毒AdHGF后血清中抗腺病毒抗体及中及抗体 　 作者：哈小琴,赵治华,吕同德,劳妙芬,吴丹莉,吴祖泽 【摘要】 目的： 观察Beagle犬重复给予AdHGF后血清中抗腺病毒抗体及抗肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）抗体的出现时间及消失 规律 . 方法 ： 将24只比格犬随机分为四组：正常对照组、手术对照组、AdHGF小剂量组(2.4×107 pfu/ kg)和AdHGF大剂量组(2.4×108 pfu/ kg). AdHGF各组犬给予不同剂量AdHGF共14次. 在给药2次后分别利用病毒中和反应和ELISA 方法检测血清中抗腺病毒抗体和抗HGF抗体. 结果： 手术组、正常对照组及实验组动物于给药前及给药3次时血清细胞均未出现明显中和反应. 给药4次后各剂量组动物血清均对腺病毒有不同程度中和作用，至停药后12 wk抗体水平很低或已不存在. 各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体. 结论： 犬肌注AdHGF 4次后动物血清中检测到了抗腺病毒抗体，停药4 wk后抗体水平有不同程度下降，直至12 wk后血清中腺病毒抗体基本消失. 毕业论文 【关键词】 AdHGF；抗腺病毒抗体；中和抗体；血清 　　0引言 　　　 　　基因 治疗 可能成为一些重大疾病如恶性肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、传染病包括艾滋病等的有效治疗手段［1］. 而基因治疗用于临床所面临的最大 问题 就是如何将治疗基因有效地转移至靶组织，其中载体的选择十分重要. 腺病毒载体是基因治疗中广为 应用 的一种载体， 目前 已成功地应用于多项基因治疗的临床试验中［2］. 我们对重组腺病毒AdHGF长期毒性试验中比格犬血清中抗腺病毒抗体进行检测 分析 ，将对AdHGF的实际应用具有指导意义. 毕业论文 　　1材料和方法 论文代写 　　1.1材料Beagle犬24只， 5~7 mo龄，体质量6~7.5 kg，雌雄各半（军事医学 科学 院动物实验中心）. AdHGF(携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒)，AdGFP(携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒)和293细胞（以腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系）均由军事医学科学院二所三室提供. 鼠抗人HGF mAb（Ramp;D），辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc ),重组人HGF蛋白纯品（Ramp;D）, DMEM(Gibco), 小牛血清（天津血研所）, 猴抗血清（军事医学科学院五所昭衍新药 研究 中心），洁净工作台（北京半导体设备一厂），CO2培养箱（Sanyo）, IX70倒置荧光显微镜（Olympus）,PM30自动照相系统（Olympus）. 　　1.2方法 　　1.2.1动物分组设正常对照组、手术对照组、AdHGF小剂量组(2.4×107 pfu/ kg, 拟临床用量3.4倍)和大剂量组(2.4×108 pfu/ kg, 拟临床用量34倍)，每组6只. 　　1.2.2给药途径采用心肌注射和臀部肌肉注射相结合,首次心肌注射，其余13次为肌肉注射给药. 给药期限为7 wk, 2次/wk，给药次数合计14次. 给药2次后利用病毒中和反应每周检测1次犬血清中抗腺病毒抗体，直到停止注射后3 mo. 　　1.2.3犬血清中抗腺病毒抗体测定利用病毒中和反应方法，即病毒与抗血清中和后，将其感染细胞，细胞不产生病变为抗腺病毒抗体阳性，反之细胞出现病变为抗腺病毒抗体阴性，并观察绿色荧光是否出现. 将293细胞接种于96孔细胞培养板上， 5×104个/ 孔. 次日感染病毒（AdGFP）与血清的混合液: 取20 μL犬血清加8 u的青霉素，再加5×106 pfu病毒, 相当于100 MOI (multiplicity of infection, 感染强度)，混匀后37℃ 水浴 30 min. 吸弃原培养液，加入上述混合液，每个样品双份，每孔加入200 μL，以小牛血清加病毒液作阴性对照, 猴抗血清为阳性对照，置37℃，50 mL/L CO2的培养箱继续孵育. 24，36，48 h观察荧光及CPE(细胞病变效应). 　　1.2.4犬血清中中和抗体测定用ELISA方法测定血清中抗HGF抗体水平. 收集稳定分泌表达HGF的CHO细胞的培养上清作为抗原，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，新鲜配制的OPD 为底物显色液，测A490 nm值. 同时用抗HGF mAb作一标准曲线，以 计算 抗体的滴度. 　　2结果 　　2.1血清抗腺病毒抗体检测共12次采血，受试动物212只次，手术对照组及正常对照动物血清均出现明显CPE及强荧光(