牛FMDV受体整合素β6亚基LBD多克隆抗体制备及初步应用.doc

牛FMDV受体整合素β6亚基LBD多克隆抗体制备及初步应用 　【摘要】 目的: 利用大肠杆菌表达牛FMDV受体整合素β6亚基的配体结合域(LBD)片段, 纯化重组目的蛋白后制备兔多克隆抗体并对其进行初步应用。方法: 以含有牛整合素β6亚基全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到β6LBD基因片段, 与原核表达载体pGEX 4T1相连, 构建原核表达质粒pGEX/β6LBD, 测序确认开放阅读框正确后, 转化感受态细胞BL21(DE3), 以IPTG诱导表达重组牛β6LBD融合蛋白。SDSPAGE和Western blot鉴定后提取包涵体, 电泳分离纯化重组融合蛋白, 免疫新西兰白兔制备多克隆抗体, 以ELISA、 琼脂扩散实验、 免疫组化鉴定该抗体的效价和特异性。结果: 重组牛β6LBD融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达, 重组蛋白主要以包涵体形式表达, 相对分子质量（Mr）约为45000。制备的兔多克隆抗体效价达1∶12800 以上, 该抗体可与牛舌上皮细胞中的抗原分子结合, 具有很好的特异性。结论: 实现了牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的原核表达和抗体制备, 为研究受体β6亚基在牛体内的分布及其在FMDV感染过程中的作用机制提供了工具。 【关键词】 牛FMDV受体 β6LBD 多克隆抗体 免疫组化 　　口蹄疫是由口蹄疫病毒（footandmouth disease virus, FMDV）引起偶蹄动物（牛、 猪、 羊、 骆驼等）共患的一种急性、 热性、 接触性传染病, 世界动物卫生组织（OIE）和中国政府分别将该病列为A类和一类动物传染病之首。FMDV属小RNA病毒科口蹄疫病毒属。完整的病毒由衣壳包裹一个分子的RNA组成, 衣壳由4种结构蛋白VP1、 VP2、 VP3和VP4组成的60个不对称原粒构成, 其中VP1、 VP2和VP3位于衣壳表面, 而VP4则完全位于衣壳里面。由VP1 140～160位的氨基酸形成的GH环突出于表面, GH环含有高度保守的RGD基序。整合素（integrin）分子可与含有RGD基序的蛋白配体结合, 这是整合素成为FMDV受体的分子基础[1]。病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的一个决定因素[2]。目前已发现至少有αvβ1、 αvβ3、 αvβ6、 αvβ6 四种整合素是FMDV的受体[3, 4], 且αvβ6是主要的功能受体[5]。β6是异源二聚体αvβ6的一个亚基, 单独存在时并不能介导FMDV感染。β6亚基胞外域中的168个氨基酸参与构成了配体结合域（ligandBinding domain, LBD）[6]。FMDV具有严格的宿主范围, 自然条件下其感染对象是猪、 牛、 羊及其他家养和野生偶蹄动物[7]。FMDV受体的发现均是以人源整合素基因进行受体重建实验的。已有实验表明, 与人源整合素相比较, FMDV能更加有效地利用牛源整合素[6], 本研究组继制备了兔抗牛αvLBD多克隆抗体后[8], 其试验实现了牛β6LBD的高效表达并制备了兔多克隆抗体。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 含有牛FMDV受体β6亚基基因的重组质粒pGEMβ6由本研究组构建（该基因在GenBank中的登录号为DQ867017）; 限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 IPTG、 Taq DNA聚合酶、 核酸marker、 DNA片段纯化试剂盒均购自宝生物（大连）工程公司; 低分子量蛋白marker购自中国科学院上海细胞生化所; 大肠杆菌菌株DH5α（克隆宿主）、 BL21（DE3）（表达宿主）、 原核表达载体pGEX 4T1、 FMDV实验感染牛舌组织均由本室保存; 溶菌酶、 弗氏佐剂均为Sigma公司产品; 硝酸纤维素（NC）膜、 透析袋为Pharmacia公司产品; HRP标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG、 DAB显色试剂盒、 GST单克隆抗体（mAb）购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 其他试剂均为国产或进口分析纯。健康新西兰大白兔（3月龄, 雄性, 体质量约2.5 kg）由兰州兽医研究所实验动物场提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物设计 参考Duque等[8]的文献报道设计引物, 上游引物P1为5′GTGGGATCCCCTCAAAGCTTGGCTCTTAA3′; 下游引物P2为5′CGACTCGAGGTCCGCGTCACTCACAAAGA3′, P1和P2引物的5′端分别引入了酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ, 这对引物用于扩增牛β6 LBD片段, 预期大小为504 bp。 　　1.2.2 重组质粒的构建 以重组质粒pGEMβ6为模板, P1和P2为扩增引物进行PCR反应。扩增得到的片段经BamHⅠ/XhoⅠ 双酶