牛乳中蛋白氮测定.doc

牛乳中蛋白氮测定 　 作者：高美玲，袁宝帅 祝旭，王雪，郑新秀， 顾英 【摘要】 目的 改进牛乳中蛋白质含量测定方法——凯氏定氮法。方法 改进样品预处理方法，将牛乳在90℃加热25min;调节溶液的pH为4.8，用5倍于牛乳体积的95%乙醇沉淀蛋白质，过滤后用浓硫酸消化蛋白质沉淀。结果 方法的测定结果在置信度95%时，置信区间是(3.12±0.09)%， RSD为3.68%。结论 选择乙醇作蛋白质的沉淀剂，能简便、快速、准确地检测出牛乳中的纯蛋白质含量。 【关键词】 牛乳;蛋白氮;测定 目前我国测定牛乳中蛋白质含量的方法是凯氏定氮法。该法测得的结果既包含蛋白氮含量，也包括非蛋白氮含量，这就为不法商贩提供了往乳中掺入尿素、三聚氰胺等含氮物质，以增加蛋白质含量的机会。因此建立一种能够检测乳中纯蛋白质含量的分析方法，对加强牛乳管理、规范生产和市场具有极其重要的意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 原理 　　用乙醇沉淀牛乳中的蛋白质，离心分离得到蛋白质沉淀，沉淀经硫酸消化，使蛋白质中的氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加氢氧化钠溶液蒸馏，用硼酸吸收后再以标准盐酸溶液滴定，根据标准盐酸消耗量计算样品中纯蛋白质的含量。 　　1.2 主要仪器及试剂 　　1.2.1 仪器 　　KDY-04A凯氏定氮仪(金坛市盛蓝仪器制造有限公司);TDL-5-A 低速台式大容量离心机(无锡建议实验器材有限公司);FA2004分析天平(上海高精度电子天平生产厂);LNK-882多功能快速消化仪(宜兴市科教仪器研究所);DK-98-1型电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)。 　　1.2.2 试剂 　　95%乙醇，20%柠檬酸溶液，0.05 mol/mL盐酸标准溶液，4%的硼酸溶液，浓硫酸，混合指示剂(5 份0.2%溴甲酚氯乙醇溶液与1 份0.2%甲基红乙醇溶液混合均匀)，40%NaOH溶液，硫酸铜，硫酸钾。 　　以上试剂均为分析纯。 　　1.3 操作步骤 　　取一定量的生鲜牛乳，置于250 mL锥形瓶中，用胶塞封口后于90 ℃水浴中，水浴加热25 min，然后取20 mL倒入50 mL带塞的塑料离心管中，用20%的柠檬酸溶液调节pH为4.8，加入100 mL 95%乙醇，充分振荡1 min后，离心分离10 min(4 000 r/min),过滤分离得到沉淀，将沉淀转移至消化管，向消化管中加入硫酸铜0.2 g,硫酸钾2 g，浓硫酸20 mL，消化完全后，定容至100 mL。取10 mL消化液在凯氏定氮仪中蒸馏后，用0.05 mol/L的盐酸滴定，计算样品中蛋白氮的含量。 　　　2 结果与讨论 　　2.1 沉淀剂—95%乙醇加入量试验[1] 　　取20 mL的生鲜牛乳6份，乙醇溶液使用量分别取70、80、90、100、110、120 mL，按1.3操作步骤进行蛋白氮含量的测定，实验结果见表1。表1 乙醇加入量对蛋白质沉淀的影响乙醇溶液使由表1实验数据可知，当牛乳用量为20 mL时，乙醇的用量在90～120 mL沉淀效果好，故本实验选择100 mL 95%乙醇作为蛋白沉淀剂，即牛乳与乙醇的体积比为1：5。 　　2.2 加热时间的确定 　　加热可使蛋白变性，而变性的蛋白更容易沉淀,分析认为，将牛乳加热处理后，可以尽可能多的沉淀牛乳中的蛋白质，特别是某些片段小且热不稳定的乳清蛋白，可减少实验误差。取20 mL生鲜牛乳，置于250 mL锥形瓶中，用胶塞封口后于90 ℃水浴中，水浴加热，按1.3操作步骤进行蛋白氮含量的测定，实验结果见表2。　表2 加热时间对蛋白质沉淀的影响加热时间05101520253035蛋白质含量由表2实验数据可知，随着加热时间的增多，蛋白质的含量逐渐增大，当加热时间到达25 min时，蛋白含量不再变化，故本实验确定的加热条件为90 ℃水浴，加热25 min。 　　2.3 酸度的调节 　　牛乳中大部分蛋白质的等电点为4.6，而变性后的乳蛋白在pH4.9时更易沉淀，将处理后的牛乳用柠檬酸调节pH后作对比进行处理，对沉淀进行蛋白氮分析，结果见表3。表3 酸度对蛋白质沉淀的影响pH4.64.84.95.05.2对照蛋白质含量由表3数据可知，在pH为4.8时蛋白质沉淀最完全，因此本实验选择用柠檬酸调节样液的pH为4.8时，再加入沉淀剂进行试验。 　　2.4精密度分析 　　按照试样的测定步骤，对同一批牛乳做了6次重复性平行测定，结果见表4。表4 精密度分析蛋白含量由实验数据可知，在置信度大于95%的时候，置信区间为(3.12±0.09)%，RSD为3.68%，说明此实验方法精密度好，能够满足测定的需要。 　　2.5