环孢菌素A、汉防己甲素及两者联合逆转K562-A02 细胞多药耐药.docVIP

环孢菌素A、汉防己甲素及两者联合逆转K562/A02 细胞多药耐药 　【摘要】 目的:探讨环孢菌素A(CsA)、汉防己甲素(Tet)及两者联合应用对人白血病耐药细胞系K562/A02多药耐药的逆转作用。方法：采用MTT法测定柔红霉素(DNR)对细胞的半数抑制量(IC50),流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞内DNR浓度。结果:DNR对K562细胞和K562/A02细胞IC50分别为0.27和21.22 mg·L-1;CsA（1 mg·L-1）及Tet（0.1 mg·L-1）单独和联合处理K562/A02后，DNR的IC50分别为7.83、5.32和2.32 mg·L-1;CsA和Tet对DNR作用K562的IC50无明显影响；K562/A02细胞48 h凋亡率为2.19%，DNR(1 mg·L-1)作用K562/A02细胞凋亡率为2.70%，CsA和Tet单独及联合处理后凋亡率分别为10.27%、17.64%和52.79%；两药处理后细胞内化疗药物DNR浓度亦明显增加。结论:CsA及Tet均可逆转耐药,且联合作用逆转效果更强。 【关键词】 环孢菌素A; 汉防己甲素; K562/A02细胞; 多药耐药 化疗是目前治疗肿瘤的重要手段之一，而多药耐药(multidrug resistance,MDR)是导致化疗失败的主要原因。P-糖蛋白(P-gp)介导的MDR是目前肿瘤MDR研究最多的主要机制之一，研究表明，其表达与细胞强大的药物外排能力有关［1］。环孢菌素A(CsA)是一种免疫抑制剂，可调节P-gp的功能,抑制P-gp的过度表达,逆转肿瘤细胞MDR［2］；汉防己甲素(Tetrandrine, Tet)是中药粉防己块根中的主要成分,是一种非特异性的Ca2+通道阻滞剂,研究表明它可以调节多种P-gp介导的MDR细胞株的耐药［3］。两种药物单独应用在体外实验中得到了一定的逆转耐药效果，但联合应用逆转MDR国内外尚无相关报道。为了寻求有效低毒的联合耐药逆转剂，为临床治疗白血病提供实验室依据，我们以白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02为实验研究对象进行体外实验，研究联合应用以上两种药物对MDR的逆转作用。 1 材料和方法 1.1 细胞系和培养条件 敏感株K562及MDR株K562/A02由中国医学科学院血液学研究所提供,敏感细胞培养于含10%胎牛血清1640培养液中，K562/A02培养于含2 μmol·L- 1阿霉素、10 %胎牛血清1640培养液中,于实验前1周停用阿霉素。两种细胞均置于37 ℃、5%CO2培养箱中，2～3 d传代1次。 1.2 实验器材、药物及试剂 LDZ522离心机(北京医用离心机厂),SartoriusBS110S天平(北京赛多利斯天平有限公司),HZ28201K恒温振荡器(太仓市科教器材厂),Model 550酶标仪(日本BIO2RAD公司), FACSCAL BUR流式细胞仪(FCM，美国BD公司),柔红霉素（DNR,意大利Farmitalia公司）,CsA (瑞士山德士公司),Tet（江西银涛药业有限公司）,四甲基偶氮唑盐(MTT,Sigma公司,用PBS配制成5 g·L-1），胎牛血清(Hyclone公司)，RPMI 1640培养液(GIBCO公司)。 1.3 方法 1.3.1 实验分组 实验时取对数生长期细胞,细胞密度按不同实验要求进行调整:(1)对照组为K562或K562/A02细胞悬液;(2)DNR组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR；(3)DNR加Tet组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR和Tet；(4)DNR加CsA组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR和CsA；(5)DNR加Tet加CsA组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR、Tet和CsA。 1.3.2 MTT法测定逆转剂对DNR细胞毒性影响 参照文献及试剂盒说明进行。取对数生长期的耐药株和敏感株细胞，加入逆转剂(单用或联合,CsA终浓度1 mg·L-1,Tet终浓度2.5 mg·L-1)作用1 h,按所设梯度加入不同浓度DNR,每个浓度设3个复孔。血清培养液为调零孔组,不加药的细胞悬液为空白对照组,接种于96孔板,每孔含2×105个细胞悬液200 μl。置于37 ℃、5% CO2 培养箱孵育48 h后取出,加MTT反应液20 μl,继续培养4 h后于平板离心机上3 000 r·min-1离心10 min,弃上清,每孔加150 μl二甲亚砜溶解,微量振荡器混匀,酶标仪上测定540 nm波长的吸光度(A)。计算细胞的生长抑制率: 生长抑制率(％)=(1-实验孔A值/对照孔A值)×100%。 IC50 = 细胞生长抑制率为50%时的药物浓度 耐药倍数= 耐药细胞IC50/ 敏感细胞IC50 实验重复3次,每次设3个复孔,