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禽流感病毒检测技术探究进展 　［关键词］禽流感病毒；检测技术； 　　禽流行性感冒病毒简称禽流感病毒(AIV)，属于正粘病毒科、流感病毒属。流感病毒根据可溶性抗原不同可分为A、B、C ３型，只有 A 型(AIV)易变异［1］，并可在禽、人、猪、马和海洋哺乳动物中暴发流行，出现轻度呼吸疾病到严重败血症等。1878 年 AIV 在意大利首次暴发，其后在英、法、德等欧洲国家和美国均有流行。高致病性 AIV H5N1 于 1997 年在香港致 6 人死亡，2003～2004 年在亚洲致 4 人死亡，2003 年 H7N7 在荷兰致 １ 人死亡［2］。AIV 给人类健康已带来严重威胁，引起全球的极大关注，AIV 检测技术也随之成为人们研究的热点。现就近年来 AIV检测技术研究进展作一综述。 　　1 病原学检测 　　鸡胚分离培养是检测病禽组织中AIV的一种经典、准确、敏感的病原学诊断方法，可以作为金标准，特异性和敏感度均可以达到100%［2］。 　　2 血清学检测 　　21 病毒中和试验（NT） 作为经典方法，病毒中和实验操作繁琐、耗时、费料，临床几乎不用。 　　22 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验AIV 能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象又可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。血凝和血凝抑制试验可以鉴定病毒、检测血清中的抗体水平。用抗不同血凝素的抗血清，由血凝抑制试验来确定HA亚型。 　　23 神经氨酸酶抑制（NI）试验微量神经氨酸酶（NA）抑制剂抑制NA的活性，并以半抑制浓度IC50鉴定NA亚型。Hurt等［3］用5mg的抗病毒药物zanamivir建立的荧光NI试验，检测阳性样本H1N1、H1N2，符合率分别为N1 955%，N2 897%，平均935%（187/200）。该方法成本低，适于大规模地应用。 　　24 琼脂凝胶扩散试验（AGP） 用于检测AIV共同抗原核蛋白或基质蛋白。由于所有的AIV 都具有型特异性共同抗原，用一种AIV的抗原或抗血清就可对所有AIV 的抗体或抗原进行鉴定。免疫双向扩散及免疫电泳中以沉淀线判定可以定性，免疫单辐射扩散试验可以定量。 　　25 免疫荧光技术(IFT) 将抗原或抗体标记上荧光素，再进行抗原抗体反应。最早用于流感病毒是鉴定和定位病毒感染细胞中特异性的抗原、核蛋白(NP)或基质蛋白(MP)抗原。用NP抗原的荧光抗体染色，主要出现核内荧光；用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也可出现部分荧光。 　　26 酶联免疫吸附试验(ELISA) 运用ELISA原理建立的AIV检测方法较多，如用单克隆抗体介导的、经生物素一亲和素系统放大的H5亚型禽流感病毒捕获ELISA检测方法，为进一步研究检测试剂盒提供基础［4］。AIV抗体胶体金检测试纸条则是胶体金免疫层析分析法，用纯化病毒与胶体金颗粒偶联，吸附在玻璃纤维上制作而成，不需要其他试剂,一步完成,反应时间只需要几分钟(5～10min)，是一种检测微量AIV抗体快速、简便的方法［5］。郑其升等［6］用基因工程重组HA蛋白作为抗原建立了检测AIV 抗体的间接ELISA方法，可以检测H3、H5、H7、H9亚型血清，特异性高，与传统HI方法比较，符合率为 971%（774/807）。基于重组HA蛋白的间接ELISA方法可望用于AIV的保护性抗体水平检测。 　　3 单链构型多态性(SSCP) 　　作为检测基因变异的手段已得到广泛应用，其原理是单个核苷酸的置换引起DNA单链构象改变,在非变性电泳中足以导致泳动率变化。Quinto等［7］用高通量 SSCP 与限制性片段长度多性（RFLP）分析法对照，检测了近50株流感病毒的400多个基因片段，符合率为98%。 　　4 核酸扩增方法 　　41 RTPCR基于MP、NP 基因的高度保守区的引物，RTPCR可以鉴定AIV［810］。Lee等［9］在此基础上针对H1～H15又分别设计了15对HA基因的特异性引物，同时进行15管RTPCR，可以检测H1H15的HA亚型，该法所测80株病毒样品，与血清学方法符合率为100%。但单管单测，操作繁琐。Phipps等［11］建立了相对简便的RTPCR的AIV检测法，仅用一对引物扩增出H1～H15的HA2基因，产物由双脱氧核酸链中止法测序分析，盲测12株标准病毒和30株样品病毒，并与HI对照，完全相符。为提高扩增的灵敏度和特异性，也可采用巢式或半巢式RTPCR［8］。 　　42 多重RTPCR(mRTPCR)mRTRCR是在RTPCR基础之上实现单管多检的相对快速和经济的检测方法。 Malik等［12］建立的mRTPCR方法，检测3种不同的鸟类呼吸道病毒，与单管单检RTPCR方法结果完全相符。Yamada等［13］ 建立了包括5对引物的mRTPCR体系，可鉴别